Vitamine hidrosolubile din drojdia de bere

I INTRODUCERE

Drojdia de bere este o ciuperca microscopica din familia Saccharomycetacee. Formata dintr-o singura celula, are proprietatea de a se dezvolta rapid, mai ales in alimentele dulci si fainoase.

Este importanta in alimentatia umana pentru influenta pozitiva asupra imunitatii intestinale si sangvine. Unii o recomanda, altii nu, spunand ca nu poate fi asimilata.

Exista drojdii "inalte", numite drojdii de panificatie, care au activitate optima la 15-20° C, obtinuta ca urmare a tratamentului de uscare prin soda caustica, carbonat de sodiu sau acid clorhidric (astfel pierzandu-se 70 % din vitamine) si drojdii "joase", cu activitate optima la 5-6° C, cultivate pe cereale (orz) maltate (drojdia obtinuta in timpul fabricarii berii). Acestea din urma sunt singurele recomandate in terapeutica alimentara.

Drojdia de bere contine: 50% proteine care sunt usor digerabile toti acizii aminati indispensabili vietii; gluten si peptide in cantitate foarte ridicata; 14 saruri minerale esentiale; oligoelemente; 17 vitamine; ergosterol.

Datorita continutului mare de vitamine din grupul B, este indicata in afectiuni  neurologice (nevrite) si in special, neuromusculare sau in manifestarile nervoase ale alcoolicilor.

In drojdia de bere se gasesc vitamine hidrosolubile ca : complexul de vitamine B; vitamina C si vitamina H.

Vitaminele hidrosolubile sunt substante biologic active foarte diferite sub aspect structural.Ele au proprietatea fizica comuna de a fi solubile in apa si insolubile in solventi organici.Din aceasta grupa fac parte "Complexul vitaminic B; vitamina C; vitaminele H.

Din complexul vitaminic B fac parte mai multe substante cu structura diferita, care au insa un

rol fundamental asupra cresterii si dezvoltarii organismelor, fiind intr-o stransa interfunctionalitate.

Vitaminele B se gasesc in general impreuna, in aceleasi produse vegetale, iar deficienta vitaminica B nu e in cele mai multe cazuri vindecata de o singura vitamina, ci de mai multe vitamine B, care au actiune sinergica, fapt pentru care poarta denumirea de "complexul vitaminic B".

Din grupa sau complexul vitaminelor B fac parte vitaminele B₁, B₂, B₆, B₁₂, acidul pantotenic (vitamina B₅), nicotinamida (vitamina B₃), vitamina H (vitamina B₈,biotina), colina.

Lipsa din hrana a vitaminelor din complexul B se manifesta in diferite moduri, predominand starile de insomnie, nervozitate, depresiune nervoasa, albirea si caderea parului, tulburari cutanate si digestive, constipatie, inapetenta, anemii, modificari la nivelul limbii.

II STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII IN DOMENIUL TEMEI ABORDATE

VITAMINELE HIDROSOLUBILE DIN DROJDIA DE BERE

Fig.2.1. Cuburi de drojdie de bere

2.1. GENERALITATI

Drojdia de bere este o ciuperca microscopica din familia Saccharomycetacee, subspecia S. Cerevisiae.Este formata dintr-o singura celula, are proprietatea de a se dezvolta rapid, mai ales in alimentele dulci si fainoase.

Folosirea ei in preparate supuse focului distruge partial vitaminele din celulele drojdiei. Drojdia nu se va bea sau manca cu suc de fructe, biscuiti sau paine, deoarece se formeaza bere in stomac. Pe langa fermentatia alocoolica se mai formeaza ulei de fusel, alcooli toxici si acizi nocivi pentru ficat si rinichi care au efect daunator asupra vitaminelor din drojdie.

Drojdia are proprietati antianemice, antitoxice, stimulante, remineralizante. In drojdia de bere exista complexul de vitamine hidrosolubile B si vitamina C.

Intareste sistemul imunitar si combate bolile infectioase. Este bogata in elemente alcaline, ca sodiu si potasiu. Favorizeaza asimilarea alimentara si este un catalizator pentru substantele hidrocarbonate. Combate tulburarile digestive: constipatie, diaree, colite. Este foarte eficienta in avitaminoze, denutritie, slabiciune. Ajuta la crestere, rahitism. Sportivilor le mareste rezistenta la oboseala, favorizand travaliul muscular si usurand eliminarea de toxine.

In categoria vitaminelor hidrosolubile intra complexul vitaminc B, vitamina H si vitamina C. In stare cruda, drojdia de bere contine o combinatie perfecta de substante nutritive: 50 % proteine, 30 % glucide, 5 % lipide, toti acizii indispensabili vietii, diastaze, mult gluten si peptide (cu actiune preponderenta in fenomenele vitale, in reactiile de oxido-reducere, in dezintoxicare), lecitina sau grasimi fosfarate, zaharuri, saruri minerale, vitamine.

Vitaminele din complexul B nu se depoziteaza in cantitati mari in diferite organe si tesuturi,

cu exceptia vitaminei B₁₂ care se depoziteaza in ficat.Restul vitaminelor B se mentin in circulatia sanguina la un continut necesar functiilor biologice pe care le indeplinesc, excesele fiind eliminate prin urina.

Vitaminele hidrosolubile sunt substante biologic active foarte diferite sub aspect structural.Ele au proprietatea fizica comuna de a fi solubile in apa si insolubile in solventi organici.

Din complexul vitaminic B fac parte mai multe substante cu structura diferita, care au insa un rol fundamental asupra cresterii si dezvoltarii organismelor, fiind intr-o stransa interfunctionalitate. Numeroase vitamine B indeplinesc rolul de coenzime, participand activ la infaptuirea metabolismului intermediar, luand parte la numeroase procese metabolice din organismele vegetale si animale.

Vitaminele B se gasesc in general impreuna, in aceleasi produse vegetale, iar deficienta vitaminica B nu e in cele mai multe cazuri vindecata de o singura vitamina, ci de mai multe vitamine B, care au actiune sinergica, fapt pentru care poarta denumirea de "complexul vitaminic B".

Activitatea biochimica a acestor vitamine se datoreaza in principal indeplinirii rolului de coenzime, care participa la infaptuirea unor procese biologice fundamentale pentru viata organismelor (respiratie , biosinteza, metabolism energetic, inmagazinarea si transmiterea informatiei genetice).

Vitaminele hidrosolubile se deosebesc de cele liposolubile sub mai multe aspecte.Excesul de vitamine hidrosolubile din celule si lichidele biologice este usor excretat prin urina, astfel incat cazurile de toxicitate sunt rare in comparatie cu vitaminele liposolubile.

In popor se spune ca vitaminele hidrosolubile nu se depoziteaza in corp, ceea ce nu este tocmai corect deoarece si aceste vitamine se depoziteaza in diferite tesuturi si organe, dar in cantitati foarte mici. In timp ce vitaminele liposolubile nu indeplinesc rolul de coenzime, cele hidrosolubile iau parte la numeroase procese metabolice sub forma de coenzime cu rol insemnat atat in reactiile de oxidoreducere, carboxilare si decarboxilare, hidrogenare-dehidrogenare, in reactii de transfer, cat si in hematopoieza.

Pe baza a numeroase cercetari, efectuate in diferite tari, in secolele XVII si XIX s-a constatat ca vitaminele B₁ si B₂ nu se gasesc in general singure, in diferite surse vegetale sau animale, ci asociate cu alte vitamine, dintre care unele si-au dezvaluit cu greu "inrudirea". Totodata s-a remarcat ca unele vitamine din complexul B actioneaza in acelasi sens, se completeaza si se influenteaza reciproc, ca fac parte dintr-un "ansamblu"(complex) vitaminic, indispensabil metabolismul celular (nutritie, catabolism , anabolism).Unele vitamine din complexul B nu au eficienta maxima daca se administreaza singure in diferite tratamente, ci numai asociate cu alte vitamine cu actiune sinergetica.

Fiecare vitamina B pare sa indeplineasca rolul de catalizator si reglator pentru activitatea celorlalte vitamine B, cu actiune sinergetica. Vitaminele B se completeaza unele pe altele in diversele lor functii, nu numai intre ele, ci si cu alte vitamine (A, C, D). Experimental s-a demonstrat ca o alimentatie sanatoasa, echilibrata in substante nutritive, asigura nevoile zilnice in vitamine ale organismului uman.

Este convingator sa amintim ca 20g de drojdie uscata contin 10-20 mg vitamina PP, doza zilnica necesara pentru om, iar 2g de patrunjel proaspat contin aproximativ 20 mg vitamina C, aproximativ 25% din nevoile zilnice ale omului.

2.2. CLASIFICAREA VITAMINELOR HIDROSOLUBILE

In categoria vitaminelor hidrosolubile intra complexul vitaminic B, vitamina C si vitamina H.

Vitaminele hidrosolubile sunt substante foarte diferite sub aspect structural.

Vitaminele hidrosolubile din drojdia de bere sunt:

Complexul Vitaminic B

Vitamina C

Vitamina H

Complexul vitaminic B cuprinde toate vitaminele din grupa B: B_1, B _2, B_3, B5, B6, B9, B_12, vitamina H (biotina).

Termenul de vitamina B a fost folosit la inceputul secolului nostru pentru a denumi factorul carential al bolii beri-beri ,extras din orezul nedecorticat.

In prezent se stie ca nu este vorba despre o vitamina B ci despre un complex de vitamine B substante ce au urmatoarele particularitati comune:

● provenienta (drojdia de bere);

● solubilitatea in apa;

● rolul nutritional fundamental in activitatea metabolismului celular

Vitamina B₁ (tiamina)

A fost izolata in anul 1911 de Funk, din taratele de grau.

Vitamina B₁ se mai numeste tiamina, deoarece contine sulf si azot

aminic in molecula sa, aneurina si vitamina antiberiberi, pentru ca vindeca boala beri-beri.

Are un rol insemnat in metabolismul intermediar, in procesele de crestere si dezvoltare, in procesele de biosinteza si catabolism, in prevenirea si tratarea unor afectiuni digestive, hepatice, ale sistemului nervos, endocrin si muscular, fiind totodata un factor de crestere pentru numeroase microorganisme. Are un miros caracteristic care il imprima si drojdiei.In lumina UV prezinta spectre de absorbtie caracteristice. Este stabila la o temperatura obisnuita, peste 100 grade C se descompune.

Vitamina B1 are formula generala C₁₂H₁₇ON₄S, iar formula structurala este urmatoarea:

fig.2.2. Structura moleculara a tiaminei

Vitamina B1,3-(4-amino-2-metil-pirimidil-5-metilen)-5'-(beta-hidroxi-etil)-4'-metiltiazol, este formata dintr-un nucleu pirimidinic si unul tiazolic, unite printr-o punte metilenica (-CH₂-) care se leaga de atomul C-5 din nucleul pirimidinic si de atomul de azot (N-3') din nucleul tiazolic.Pe nucleul pirimidinic se gaseste un radical metil la C-2 si o grupare aminica la C-4,iar pe nucleul tiazolic se gaseste un radical metil la C-4' si o grupare hidroxietil la C-5'.

Vitamina B1 este deci un derivat de pirimidina si de tiazol continand in molecula doua cicluri, un heterociclu hexagonal cu doi atomi de azot si un heterociclu pentagonal cu un atom de azot si unul de sulf. In comert , vitamina B₁ se gaseste sub forma de clorhidrat de tiamina (C₁₂H₁₈ON₄SCl₂), forma curenta sub care aceasta vitamina se gaseste in farmacii. Se extrage sub forma cristalina din cojile boabelor de orez si se obtine si pe cale de sinteza.

Proprietati fizice si chimice:

Vitamina B₁ pura se prezinta sub forma de pulbere alba sau de cristale aciculare, incolore, care cristalizeaza cu o molecula de apa. Cristalizeaza in sistem monochimic, are punctul de topire la 221˚C, iar in solutie prezinta un punct izoelectric la pH 9,2.

Este sensibila la actiunea luminii ultraviolete, in special la radiatii cu lungimi de unda la 256 nm, care o inactiveaza rapid la pH 7.Rezistenta la caldura este mult influentata de conditiile mediului in care se afla. Pulberea cristalina uscata suporta o temperatura de 100˚C timp de 24 de ore, fara sa se degradeze.Tiamina este optic inactivata si se distruge sub actiunea radiatiilor ultraviolete.

Vitamina B1 este solubila in acetona si cloroform. Solubilitatea sa creste in mediu bazic.Tiamina are un miros caracteristic, pe care il imprima drojdiei de bere. In solutii alcaline, tiamina se transforma instantaneu intr-un produs de culoare galbena cu o fluorescenta albastra, care sub aspect chimic corespunde unui amestec de substante colorate, reunite sub numele de chinccrome.

Surse de vitamina B_1:

Vitamina B1 are o larga raspandire in natura fiind prezenta in toate organismele vegetale si animale.Ea se gaseste de asemenea in toate alimentele de origine vegetala si animala,dar continutul sau este diferit de la un produs la altul. Printre sursele naturale bogate in vitamina B₁ fac parte drojdia de bere, semintele cerealelor nedecorticate (orez, grau, orz, porumb, ovaz), ficatul, rinichii, muschiul de porc.Deosebit de bogate in vitamina B₁ sunt extractele apoase din drojdia de bere, drojdia alimentara, cojile cerealelor, unele ciuperci.

Continutul vitaminei B1 din plantele verzi variaza intre 2,5 si 10mg g. In germenii de grau si tarate de orez, vitamina B₁ are un continut de 1,6-2,4mg%, iar in produsele animale intre 0,1-0,4mg%.

In drojdia de bere continutul vitaminei B₁ variaza intre 5 si 25 mg/100g, in germenii de orez intre 2,8-3,5 mg/100g, iar in extract de drojdie de 30 mg/100g.

Continutul mediu al vitaminei B₁ in alimente de origine animala, exprimat in mg/100g se prezinta astfel: 0,6 la carnea de vita, 0,1-0,2 la carnea de miel, 0,8-1 la carnea de porc, 0,1 la pasare, 0,02 la laptele uman, 0,04 la lapte de vaca si capra, 0,3-0,5 la galbenusul de ou.

Fructele, produsele lactate si pestele sunt surse sarace in vitamina B₁.Aportul adus de fructe, legume, lactate, produse din carne in vitamina B₁ este totusi insemnat avand in vedere masa mare din aceste produse care intra zilnic in consumul alimentar al oamenilor.

Painea alba este foarte saraca in vitamina B₁, deoarece aceasta se pierde in procesul de obtinere a fainii albe, tratata cu oxidanti. Painea integrala si cea dietetica au un continut cu mult mai mare de vitamina B₁ decat painea alba.

In stabilirea dietei alimentare este neceasar sa se tina seama ca prin fierberea alimentelor cu apa, aproximativ 30% din continutul vitaminei B₁ trece in solutie, iar acest procent creste daca se arunca apa de la prima fiertura.Adaugarea de bicarbonat sau alte saruri alcaline mareste degradarea cantitatii de vitamina.La prepararea conservelor in cutii si incalzirea acestora in autoclave la 120˚C, pierderile se ridica pana la 70-80%.

Conservarea prin uscare cauzeaza pierderi relativ mici in vitamina B₁, pana la 10-15%.

Rolul tiaminei

Actiunea biologica a tiaminei, la fel ca si a altor vitamine din complexul B, se datoreaza in cea mai mare parte contributiei acestora la formarea unor enzime .

Este necesara bunei functionari a sistemului nervos central si mai ales al celui periferic.Joaca rol insemnat in mecanismul umoral al excitatiei nervoase impreuna cu acetilcolina.Tratamente efectuate cu vitamina B₁ duc la vindecarea unor tulburari biochimice.Timpul de injumatatire a "vietii" tiaminei in corp este de 5,5-19,5 zile. Majoritatea produsilor sai de degradare se elimina prin urina.

Tiamina favorizeaza, pe de alta parte, absorbtia oxigenului, metabolizarea glucidelor si biosinteza lipidelor din glucide. Stimuleaza pofta de mancare si activeaza miscarile peristaltice ale intestinelor.

2.2.2. Vitamina B₂(riboflavina)

Denumirea oficiala actuala a vitaminei B₂ este de riboflavina. Anterior riboflavina se numea vitamina G si respectiv lactoflavina, ovoflavina, hepatoflavina, etc.Cei mai multi din acesti termeni deriva de la sursa din care vitamina a fost initial izolata, respectiv din lapte, oua, ficat, plante.

Existenta vitaminei B₂ in lapte a fost remarcata prima data in 1879, cand s-a extras din zerul de lapte un pigment galben-verzui, puternic fluorescent, caruia i-a fost atribuit numele de lactoflavina.

Ulterior, in perioada anilor 1920-1932 acelasi compus s-a extras din albusul de ou, fiind numit ovoflavina, din ficat s-a extras hepatoflavina, iar din drojdii si unele plante ierboase s-a extras verdoflavina numita si liocrom, care ulterior s-a dovedit a fi identic cu "fermentul galben",izolat din drojdia de bere, mentionandu-se rolul important al acestei enzime in respiratia celulara.

Dupa stabilirea structurii moleculare a vitaminei B₂, confirmata si prin sinteza totala a acesteia, Consiliul Farmacistilor si a Chimistilor din S.U.A. ii atribuie denumirea generica de riboflavina, termen in care se includ toate flavinele naturale izolate anterior (lactoflavina, ovoflavina,hepatoflavina, verdoflavina, liocrom, uroflavina), fiind compusi identici, extrasi din surse naturale diferite.

Termenul de riboflavina se datoreaza prezentei in molecula a ribitolului, culorii galben-verzui si proprietatilor sale fluorescente.

Vitamina B2 are formula elementara C₁₇H₂₀N₄O₆, iar sub aspect structural este formata dintr-un nucleu izoaloxazinic si ribitol (6,7-di-metil-9-(D-1'-ribitil)-izoaloxazina) de la care ii provine si numele de riboflavina . Sub aspect chimic, riboflavina este un derivat al izoaloxazinei, avand ca substituenti doua grupari metil la C-6 si C-7, iar la N-9 un ribitil. Nucleul izoaloxazinic determina culoarea galben-verzuie si fluorescenta a riboflavinei, la un pH cuprins intre valorile 3-9.

Substituirea hidrogenului de la N-3 determina disparitia flourescentei fapt ce explica de ce unele flavinenzime nu au fluorescenta, deoarece hidrogenul de la N-3 este substituit prin legarea proteinelor de coenzime.

fig.2.3. Structura moleculara a riboflavinei

Pe cale industriala vitamina B₂ se obtine prin fermentarea zerului sau a laptelui smantanit cu Clostridium acetobutylicum, Candida guillermondia, C. Tropicalis, obtinandu-se intre 50-60 mg riboflavina dintr-un litru de lichid fermentativ,cu conditia ca sursa de carbon utilizata sa fie glucoza.

Proprietati fizice si chimice:

Riboflavina este o substanta solida, cristalina, de culoare galbena sau galben-portocalie, cu gust amar, optic activa. Prezinta 3 forme polimorfe cristaline, cu puncte de topire diferite, cuprinse intre 280-290sC, cu descompunere. La 240sC incepe sa se inegreasca.

Riboflavina cristalizata sub forma aciculara (ace fine) are punctul de topire la 290sC, iar cea cristalizata sub forma de placute (lamele) se topeste la 280 sC.

Este usor solubila in solutii alcaline, piridina, acid acetic, alcool amilic, ciclohexanol, fenol si practic insolubila in cloroform, benzen, acetona, eter de petrol, etanol. In apa este putin solubila, dizolvandu-se 10-13 mg/100 ml de apa la 25 sC

si 250mg la 100 sC. Are un caracter amfoter, cu punctul izoelectric la pH 6.

Este rezistenta fata de acizi si agentii oxidanti mai slabi, dar se degradeaza foarte usor sub actiunea luminii, in special a radiatiilor ultraviolete.

Surse de vitamina B₂

Vitamina B₂ este larg raspandita in natura fiind prezenta in toate celulele organismelor vegetale, animale, precum si in microorganisme.Continutul vitaminei B₂ din tesuturile verzi este relativ ridicat, variind de la 2,5 la 25 mg/g.Cele mai bogate produse horticole in vitamina B₂ sunt migdalele,alunele, ciupercile, patrunjelul, telina.Cantitati mari de vitamina B₂ contin bacteriile anaerobe si drojdiile cu mare putere de fermentare,in medie 3mg/100g. La mamifere ficatul, rinichiul, inima, splina, creierul sunt organele in care riboflavina se gaseste in cantitate mai mare(1-3 mg%).

Continutul de vitamina B₂ din drojdia de bere variaza intre 1 800-3 000 mg/100g.

Laptele proaspat de vaca contine 135-300 mg/100ml, colostrul 400-600mg/100ml, laptele praf

1600 mg/100ml. Untul este sarac in riboflavina 12mg/100g, oul intreg contine 250-440 mg/100g, albusul 230mg/100g, iar galbenusul 285-520 mg/100g.

Cantitati insemnate de riboflavina produc unele microorganisme din prestomacele ierbivorelor si din flora intestinala cum sunt:Escherichia coli,Bacillus proteus vulgaris,B. Lactis aerogenes,B. Mesentericus,B. Vulgaris.

Rolul vitaminei B₂

Vitamina B₂ are un rol important in reactiile de oxidoreducere, in procesele de crestere si dezvoltare, fiind prezenta in stare libera sau sub forma de compusi in toate celulele organismelor vegetale si animale. In stare libera este un factor de crestere pentru organismele tinere si pentru numeroase microorganisme.Ea stimuleaza secretia acidului clorhidric in stomac.

Riboflavina participa alaturi de vitamina A in procesul vederii, fapt ce justifica continutul ridicat al acestei vitamine in retina.Este unul dintre constituentii celulari, esentiali care actioneaza sub forma de combinatie proteica in fenomenele de respiratie celulara si intervine in procesele de dehidrogenare este indicat in caz de perles si de crampe musculare.

2.2.3. Vitamina B₃ (nicotinamida)

Vitamina B₃ cuprinde acidul nicotinic si amida acidului nicotinic cu proprietati aproape identice precum si o serie de derivati ai acidului nicotinic. Nucleul de baza al vitaminei este nucleul pirimidinic cu 5 atomi de C si un atom de N. Acidul nicotinic si amida nicotinica sunt substante cristaline, incolore, solubile in apa, alcool, termostabile.

In anul 1913 se reuseste izolarea acidul nicotinic din drojdii.Acidul nicotinic a fost obtinut prin sinteza de in anul 1887, prin oxidarea nicotinei. Acidul nicotinic vindeca pelagra umana, boala aparuta la bolnavii din azile hraniti cu multe preparate din porumb si cu putina carne.

In drojdia de bere continutul de vitamina B₃ variaza intre 34-93 mg/100g.

Acidul nicotinic, numit si niacina, are formula moleculara C₆H₅O₂N, iar nicotinamida C₆H₆ON₂.Nicotinamida rezulta din amidarea directa a acidului nicotinic sau a esterilor sai.

Fig.2.4. Structura moleculara a niacinei

Proprietati fizice si chimice:

Acidul nicotinic si amida nicotinica sunt substante cristaline, incolore, solubile in apa, alcool, termostabile.Sub aspect farmaceutic acidul nicotinic si nicotinamida sunt considerate cele mai stabile vitamine.Vitamina B₃ este incompatibila cu substante acide sau bazice, nicotinamida hidrolizeaza, iar acidul nicotinic formeaza saruri in mediu bazic.Cu sarurile de argint formeaza precipitate.In solutie apoasa reactioneaza cu acidul ascorbic, cu formarea unui complex de culoare galben-verde, favorizat la pH de 3,8 cu punct de topire diferit de a celor doua componente.

Surse de vitamina B₃

Vitamina B3 se gaseste sub diferitele sale forme structurale larg raspandita in natura atat in organismele vegetale, cat si in cele animale.In plante continutul vitaminelor piridinice este mai mic decat la animale.Exista totusi surse vegetale, ca drojdia de bere, care contin o cantitate mai mare de acid nicotinic, fapt ce a determinat utilizarea acestor surse in tratamentul pelagrei.

Intr-o drojdie selectionata folosita la fabricarea berii s-a gasit acid nicotinic cu un continut de 106mg/100g s.u., iar in drojdiile folosite la fabricarea painii 30mg/100g s.u.

La plante sunt mai bogate in vitamina B₃ frunzele si mai sarace legumele, fructele si semintele unor cereale (secara,porumb).La cereale, coaja bobului contine mai mult acid nicotinic decat miezul. Intrucat acidul nicotinic si amida sa nu sunt sensibili la fierbere si sterilizare, face ca cea mai mare parte din vitamina B₃ sa se pastreze in alimente si dupa prepararea acestora.In general, in timpul prepararii hranei, pierderea de vitamina este in jur de 30%.

Continutul vitaminei B₃ in drojdia de bere variaza intre 30-106 mg/100g, tarate de orez 42-96mg/100g, in extract de malt 8-10mg/100g, lapte de vaca 0,15-0,25mg/100g, fasole1,45-1,47mg/100g.Nicotinamida se gaseste la om si la animale predominant sub forma de coenzima, in ficat in stare libera sau combinata.

Continutul mediu al unor alimente,exprimat in echivalenti de niacina/1000kcal:lapte de vaca 12,4(1,2 mg niacina si 673 mg triptofan),lapte de mama 9,9(2,5mg niacina si 443 mg triptofan),carne 46(24,7 mg niacina si 1280 mg triptofan),ou integral 19,8(0,6 mg niacina si 1150 mg triptofan),faina alba de grau 7,4(2,5 mg niacina si 297 mg triptofan),porumb 6,7(5,0 mg niacina si 106 mg triptofan).

Rolul vitaminei B₃

Se elimina prin urina, fecale, tranpiratie. Vitamina B₃ previne si vindeca pelagra, caracterizata prin tabloul simptotic a celor "trei D" (dementa, diaree, dermatita). Ele participa si la procesele de oxireducere, la metabolismul glucidelor, proteinelor, a produsilor pigmentari si influenteaza sistemul nervos si activitatea unor glande cu secretie interna.E binecunoscuta si actiunea vasodilatatoare a vitaminei B₃.

Vitamina B₅ (acidul pantotenic)

Acidul pantotenic face parte din "Complexul de vitamine B ", fiind unul din cei mai raspanditi reprezentanti.Denumirea sa actuala provine de la semnificatia cuvintelor grecesti "pas pantos-peste tot", care reflecta larga sa raspandire in natura, fiind prezent in toate organismele animale si vegetale .Are un rol insemnat, luand parte activa la numeroase procese metabolice din celule si tesuturi.

Acidul pantotenic a fost considerat un component al complexului" Bios" ,descoperit in 1901, care stimuleaza cresterea drojdiilor pe medii artificiale.Se gaseste natura in stare libera, sub forma unor complexe cu proteinele si e component in structura coenzimei A (HSCoA). In stare carentiala a acidului pantotenic apar la animale afectiuni reflectand rolul metabiloc important ce revine acestei vitamine in diferite procese metabolice.

Acidul pantotenic are formula moleculara C₉H₁₇O₅N si masa moleculara 219,2. In molecula acidului pantotenic s-a pus in evidenta o grupare carboxil,prin esterificare,doua grupari hidroxil libere,iar prin hidroliza s-a pus in evidenta inca un atom de oxigen si unul de azot.

fig.2.5. Structura moleculara a acidului pantotenic

Proprietati fizico-chimice

Vitamina B5 se prezinta ca un ulei galben-deschis, vascos, solubil in apa si acid acetic, putin solubil in etanol, benzen, cloroform. Prezinta o mare adsorbtie de afinitate fata de carbunele activ.

Este substanta optic activa, dextrogira(+37,5s), stabila in mediu acid la pH 5,5-7, dar instabila la incalzire.

Acidul pantotenic este unul din cei mai stabili componenti care fac parte din complexul B.

In medii mai acide si in cele alcaline este instabil, fiind repede hidrolizat.Acidul pantotenic in solutie apoasa , la pH 5,5-7 suporta autoclavarea la 120sC, timp de 30 minute, fara descompunere.

Surse de vitamina B₅

Acidul pantotenic se gaseste in toate organismele vegetale si animale.In cantitate mai mare se afla in laptisorul de matca, drojdia de bere, faina de fasole, soia, arahide, conopida, migdale, in medie 4-40μg∕g s.u. In laptisorul de matca se gaseste intre 150-500 μg∕g, iar in produsele horticole continutul variaza intre 0,3-20 μg∕g.

Ficatul contine 25-60 μg∕g s.u., iar rinichiul 32-49 μg∕g s.u. In sangele uman, concentratia de acid pantotenic este de 18-34 μg∕100ml, cu o medie la diferite specii de 20 μg∕100ml,care scade in stari de carenta. Acidul pantotenic s-a pus in evidenta in cantitati mai mari decat in sange, in glandele suprarenale, inima, splina, creier, pancreas si plamini.

Alimentele preparate au un continut mai redus de acid pantotenic decat sursele primare, datorita pierderilor care se produc in timpul proceselor tehnologice si culinare de obtinere a hranei. Pasteurizarea laptelui cauzeaza pierderi minore de acid pantotenic, dar in timpul fierberii si prajirii alimentelor la temperaturi mai inalte, pierderile pot fi de peste 50%.

Rolul vitaminei B₅

Forma activa acidului pantotenic o reprezinta coenzima A, numita si coenzima de acetilare, care are un rol esential in metabolismul lipidelor, glucidelor, protidelor, in biosinteza sterolilor, a hormonilor steroidici, in functionarea sistemului nervos si a aparatului imunitar.Un rol fundamental il are acetilceoenzima A in biosinteza si degradarea acizilor grasi, a sterolilor, acizilor biliari, a numeroase substante terpenice, carotenoide, in ciclu Krebs.

2.2.5. Vitamina B₆(piridoxina)

Numele de piridoxina provine de la structura sa moleculara deoarece este un alcool cu nucleu piridinic.Denumirile de adermina sau de vitamina antipelagroasa a sobolanului deriva de la proprietatea sa de a vindeca o dermatita specifica a sobolanului.

In natura vitamina B₆ se gaseste sub trei forme vitamere, care se deosebesc intre ele printr-o grupare functionala caracteristica , legata de C-4 al nucleului piridinic.

Astfel forma piridoxol sau piridoxina contine o grupare hidroxilica, piridoxalul contine o grupare aldehidica, iar piridoxamina contine o grupare aminica.

Izolarea vitaminei B₆ s-a realizat din tarate de orez, drojdii, extracte din boabe de orez nedecorticat. Vitamina B₆ cuprinde piridoxina, piridoxalul si piridoxamina. In mediu alcalin si acid sunt sensibile la lumina.

Piridoxina este un derivat de piridina substituit la C-2 cu o grupare metil, la C-3 cu o grupare hidroxil, iar la C-4 si C-5 cu cate o grupare hidroximetil.Ea contine in molecula un nucleu piridinic si are formula moleculara C₈H₁₁O₃N.

Sub aspectul structurii chimice piridoxina este 2-metil-3-hidroxi-4,5-dihidroximetil-piridina.

fig.2.6.Structura moleculara a piridoxinei

Proprietati fizico-chimice

Piridoxina in stare libera se prezinta sub forma de pulbere cristalina, incolora, cu gust usor amar si punct de topire la 160sC. Are masa moleculara 169,2 UMA.In mediu acid se comporta ca un fenol, iar in mediu bazic formeaza un anion fenolat cu N tertiar, iar in mediu neutru se prezinta ca un amfion.

Piridoxina este optic inactivata, iar cu clorura ferica formeaza un compus de culoare galben-rosie.Da o coloratie rosie prin incalzirea sa cu cloroform si etilat de sodiu.Se distruge usor sub actiunea radiatiilor ultraviolete.Toate formele vitaminei B6 sunt sensibile la actiunea luminii.Ele prezinta in UV spectre de absorbtie caracteristice care depind de pH.

Vitaminele B6 sunt rezistente la fierbere la 100sC, atat in mediu acid cat si in mediu bazic,cu exceptia piridoxalului, care este sensibil in solutie alcalina.

Surse de vitamina B₆

Vitamina B₆ este larg raspandita in organismele vegetale si animale.Sursele cu continut ridicat de vitamina B₆ sunt drojdia de bere, coaja bobului de orez, polen, semintele cerealelor, ficatul animalelor, carnea de peste, galbenusul de ou.

In general vitamina B₆ apare in natura sub forma de complexe, egata de proteine sau amidon , precum si sub forma de complexe organo-metalice si mai putin in stare libera.

Din muschiul de peste, prin extractie cu apa, nu se poate obtine decat 25% din totalul vitaminei B ₆, fiind nevoie de o hidroliza papainica pentru extragerea cantitatii totale.

In cantitate mai mare se gaseste in ficat, care se pare ca reprezinta principalul organ de depozit.

Continutul mediu de vitamina B₆ al unor alimente raportat la 100g aliment:muschi de vita 0,5 mg, somon 1 mg, paine integrala 0,36mg, ou de gaina 0,12mg, nuci 0,87mg.

Prin prelucrarea alimentelor se pierd cantitati mari de vitamina B₆.Astfel prin fierberea sau frigerea carnii se pierd 50% din vitaminele B6, iar la obtinerea unor preparate lactate intre 36-70%.La prepararea conservelor de legume se pierd 77% din vitaminele B₆, iar la obtinerea fainii foarte fine intre 50-93%.

Rolul vitaminei B₆

Vitamina B₆, sub cele trei forme structurale,are un rol multiplu si complex in organismele vegetale si animale.

Mai ales sub forma de piridoxalfosfat, cu rol de coenzima, ia parte in numeroase procese metabolice ale proteinelor, glucidelor, lipidelor si a altor substante, contribuind atat la biosinteza, cat si la degradarea unor compusi (aminoacizi, monoglucide, acizi organici, compusi heterociclici), precum si la stabilirea unor interconversiuni si a unor interrelatii metabolice intre diferite grupe de substante, dand posibilitatea organismului sa utilizeze cat mai eficient substantele existente in hrana. Intervine in formarea adrenalinei.

Are o atributie importanta in reglarea activitatii nervoase.

2.2.6.Vitamina B₉ (acidul folic)

Grupul generic al" acizilor folici "este constituit dintr-un "complex de vitamine B",care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroiglutamic, au actiune hematopoietica si leucopoietica, dar se deosebesc intre ele prin actiunea specifica pe care o au asupra diferitelor microorganisme si specii de animale.

Acizii folici au un rol insemnat in formarea globulelor rosii si albe din sange,in prevenirea si tratarea anemiilor,sunt factori de crestere pentru numeroase organisme.

Acidul folic se poate obtine in stare cristalina din diferite surse naturale (ficat, spanac, drojdiile, cojile cerealelor) prin extractie cu apa la pH 3, adsorbtie pe carbune activ, elutie cu solutie amoniacala 2,8%, purificat prin readsorbtie pe carbune, eluare cu anilina si precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritina.In produsele naturale acidul folic se gaseste in stare libera in cantitate relativ redusa deoarece se gaseste in cantitate mai mare sub forma de compusi chimici diferiti, unii cu mai multe resturi de acid glutamic, care au insa aceeasi importanta nutritiva pentru organismele vii.

Acidul folic se mai numeste si acid pteroiglutamic, denumire ce provine de la structura sa chimica. Acidul folic are o structura complexa, fiind format dintr-un nucleu pteridinic, o molecula de acid p-aminobenzoic si una de acid glutamic. Legatura dintre nucleul pteridinic si acidul p-aminobenzoic se realizeaza printr-o punte metalica, iar legatura dintre acizii p-aminobenzoic si glutamic se face printr-o legatura peptidica.

fig.2.7.Structura moleculara a acidului folic

Proprietatile fizico-chimice

Acidul folic este o substanta solida, cristalina, de culoare galbena, greu solubila in apa, piridina, fenol, metanol si insolubil in cloroform, benzen, eter si acetona. Este optic activ dextrogir(+)16s, iar in mediu acid, la pH 4-12 este stabil. Acidul folic se descompune sub influenta luminii si a razelor UV, rezultand acid pteridoxamin-6-carboxilic si alti compusi proveniti din catena laterala.

Acidul folic se prezinta sub forma de placute galbene, lenticulare, subtiri, birefrigerente, cu punct de topire la 250sC.Prin autoclavare 30 minute, pierde 70% din activitate la pH 1.

Este incompatibil cu substante oxidante sau reducatoare deoarece se degradeaza.

Surse de vitamina B₉

Acidul folic si derivatii acestuia au o larga raspandire in alimente.Se gasesc in cantitate mai mare in ficatul animalelor, in frunzele plantelor superioare, in special in spanac, mazare, germenii de grau, drojdii, sfecla, lamai si in unele microorganisme.Continutul acidului folic din plantele de porumb este de 11,5μg∕g,i ar in frunzele mature de 6-7μg∕g.

In ficatul de pui 370 μg%, iar in cel de porc 220 μg% acid folic.Cerealele contin in medie 35μg% ,iar dintre fructe, lamaile 80μg%, bananele 30μg%, portocalele 23 μg%.Legumele au un continut mai redus, fiind cuprins intre 8 si 25 μg%.

Laptele de vaca contine cantitati mici de acid folic.In timpul prepararii alimentelor o parte din folati se distrug, dar in acelasi timp se elibereaza cele aflate in complexe inactive sau sub forma conjugata. Cantitati mari de folati se pierd in timpul extragerii,la prepararea hranei in solutii apoase si prin fierbere.Uneori pierderile totale se ridica pana la 85-90%.

Rolul vitaminei B₉

Este un factor important pentru cresterea animalelor tinere si pentru diferite microorganisme.Este utilizat tot mai mult in lupta impotriva cancerului.Asigura functionarea optima a sistemului nervos.A manifestat efecte antiteratogene la animale tratate cu pirimetamina.

Acidul folic este utilizat cu succes in tratamentul anemiilor nutritionale la gravide.

El stimuleaza biosinteza globulelor albe si rosii, dar nu are actiune asupra afectiunilor nervoase ale acestor boli. Stimuleaza absorbtia vitaminelor liposolubile.

Acidul folic se adauga in numeroase produse alimentare pentru a le mari valoarea biologica, prevenirea anemiilor, buna functionare a eritrocitelor si a sitemului nervos.

Se adauga in special in produse de patiserie, paine, sucuri, bauturi nealcoolice, cereale pentru micul dejun.

Vitamina B₁₂ (cobalamina)

Vitamina B₁₂ este indispensabila pentru viata omului si a animalelor. Ea are o deosebita importanta in ce priveste cresterea, hematopoieza si functionarea celulei nervoase. In 1949, se reuseste izolarea a doua forme cristaline de vitamina B₁₂ cu acelasi efect in vindecarea anemiei pernicioase.O forma continea gruparea cian si s-a numit cianocobalamina iar alta forma continea gruparea hidroxil si s-a numit hidroxicobalamina.Este un factor de crestere pentru numeroase microorganisme.Denumirea de cianocobalamina deriva din structura sa moleculara intrucat contine gruparea cian-,un atom de cobalt si grupari amidice.

Vitamina B₁₂ se mai numeste si cianocobalamina, antianemica, vitamina antipernicioasa, corinoida, factor antipenicios, factor anemic extrinsec, factorul proteinelor la animale.

Dintre diversii compusi de cobalamina care prezinta activitatea vitaminica, formele cele mai active sunt ciancobalamina si hidroxicobalamina.

Stabilirea structurii moleculare a vitaminei B₁₂ s-a efectuat cu multa greutate, pe baza colaborarii unor renumiti cercetatori din mai multe domenii de activitate, folosind diferite metode moderne de cercetare ,o perioada indelungata de timp, din 1948 si pana in 1973, cand s-a realizat sinteza chimica totala a acestei vitamine.

Vitamina B₁₂ are formula moleculara C₆₈H₉₀N₁₄PCo si are masa moleculara 1490±140 in functie de gruparile functionale legate de atomul de cobalt.Pe baza analizei compozitiei chimice a vitaminei B₁₂ s-a stabilit ca in molecula acesteia se gaseste un atom de Co(4,5%), un atom de P(2,34%), un numar egal de atomi de azot si de oxigen, precum si numerosi atomi de carbon si hidrogen, asa dupa cum reiese din formula mentionata.

Din punct de vedere chimic vitamina B12 contine un nucleu porfirinic modificat numit nucleu corinic, o ribonucleotida ce are ca baza azotata 5,6-dimetilbenzimidazolul si aminopropanol.

Compusii corinici cu Co³+ au culoare rosie, cei cu Co²+ au culoarea portocalie-bruna, iar cei cu Co¹+ au culoarea verzuie, fiind instabili, usori reoxidati la aer.

fig.2.8. Structura moleculara a cobalaminei

Proprietatile fizico-chimice

Cobalamidele sunt substante solide, cristaline, de culoare rosie, solubile in apa, etanol, metanol si insolubile in mediu acid (pH 4,5) si la cald. Nu rezista la actiunea oxidantilor puternici, a acizilor si bazelor tari si a luminii.In solutie apoasa , vitamina B12 prezinta un spectru de absorbtie caracteristic, cu maxime la 272,361 si 550 nm.Este optic activa, levogira(-59s) si rezista la incalzire 20 minute la 120sC.Vitamina B12 se prezinta sub foma unor cristale aciculare, birefrigerente, de culoare rosu-inchis, care contin 8-12 % apa de cristalizare, fara punct de topire bine determinat.

Lumina, in special razele ultraviolete, descompun vitamina B12 aflata in solutie.

Este incompatibila cu substante cu reactie puternic acida sau alcalina, cu agenti oxidanti sau reducatori, cu sarurile unor metale grele.

Surse de vitamina B₁₂

Dintre sursele alimentare folosite de om mai bogate in vitamina B₁₂ sunt ficatul (35-50μg∕100g s.u.), rinichiul(15-20μg∕100g), carnea(5μg∕100g), ouale(3μg∕100g) si laptele(2μg∕100g), restul alimentelor au un continut foarte mic de vitamina.

Ficatul de vitel, ficatul pestilor si al crustaceelor contine aproximativ 2,4 ppm∕g s.u..Un continut relativ mai mare de vitamina B₁₂ se gaseste de asemenea in splina si in culturile unui mare numar de actinomicete si bacterii.

Produsele de origine vegetala sunt lipsite de aceasta vitamina.Continutul total al vitaminelor B₁₂ se apreciaza la oamenii adulti intre 1 si 11 mg, cu o valoare medie de 3-5mg. Vitamina B₁₂ este depozitata predominant in ficat, cu un continut total de 1-10mg, iar o valoare medie de 1,5-2mg.In rinichi, inima, splina, creier continutul total al vitaminelor B₁₂ este cuprins intre 20-30 μg pentru fiecare organ.

Rolul vitaminei B₁₂

Vitamina B₁₂ impreuna cu formele sale coenzimatice (5'-dezoxiadenozincobamida ,metilcobamida) au un rol esential pentru om si animale in procesele de crestere, hematopoieza, mentinerea integritatii celulei nervoase precum si in reactiile metabolice ale proteinelor, lipidelor si glucidelor.

Are un rol important in biosinteza porfirinelor inclusiv a hemoglobinei. Stimuleaza biosinteza fosfolipidelor la om si animale,are un rol insemnat si in metabolismul glucidelor, favorizand gluconeogeneza, stimuleaza metabolizarea fructozei, a glicogenului si a glicerolului.Vitamina B₁₂ indeplineste rolul unui compus intermediar in formarea globulelor sanguine, a tecii nervilor si a numeroase proteine.Aceasta vitamina este esentiala pentru formarea si dezvoltarea eritrocitelor, maturarea celulelor epiteliale, in special cele din tubul digestiv, precum si in biosonteza acizilor folici si in regenerarea acidului folic in timpul formarii eritrocitelor.

Vitamina C (acidul ascorbic)

Vitamina C se mai numeste acid ascorbic ,acid hexuronic,vitamina antiscorbutica.Este cea mai veche sesizata si mai bine cunoscuta vitamina.

Denumita asa deoarece lipsa ei determina boala numita scorbut, ce se manifesta prin anemie, gingivite si diateza hemoragica (hemoragii articulare sau in organele interne).

Acidul ascorbic este lactona acidului L-glucuronic,pe care plantele si multe mamifere il pot sintetiza pornind de la glucoza si galactoza.In organism se poate gasi sub forma redusa (acid ascorbic) si sub forma oxidata (acid dehidroascorbic).

Factorul hidrosolubil C a fost izolat prima data din sucul de lamaie de catre S.S. Yilva in perioada 1923-1925.

In 1932 se stabileste structura chimica a vitaminei C.In 1975 mai multi cercetatori din diferite tari arata caracterul antioxidant al vitaminei C si proprietatea acesteia de a neutraliza oxigenul singlet.

Vitamina C sau acidul ascorbic are formula moleculara C₆H₈O_6, care sub aspect structural este γ-lactona acidului 2,3-dienol-L-gulonic ce se formeaza din acidul 2-ceto-gulonic.

Desi este un acid hexozic monocarboxilic nu are gruparea carboxilica libera deoarece este blocata sub forma unei legaturi-OH enolice,de la carbonii C-2 si C-3, al caror atom de hidrogen poate fi usor substituit cu metale.

Structura moleculara a vitaminei C se caracterizeaza prin prezenta a doua grupari -OH enolice vecine,la C-2 si C-3, intre care exista o dubla legatura, prezenta unei grupari alcoolice primare la C-6 ti a unui hidroxil secundar la C-5 in pozitie L,un ciclu furanic cu functie lactonica format intre atomii C-1 si C-4 si o catena laterala formata din 2 carboni,legata de C-4.

fig.2.9.Structura moleculara a acidului ascorbic

Proprietati fizico-chimice

Acidul ascorbic este o substanta solida, se prezinta sub forma de pulbere alba cristalina, cu punct de topire la 192sC(cu descompunere) fara miros si cu gust acru.Cristalizeaza din solutii apoase saturate sub forma de cristale monoclinice incolore.

Este o substanta optic activa dextrogira, are un spectru de absorbtie caracteristic, cu un maxim la 245 nm in solutie slab acida si la 265 nm in mediu alcalin, fapt ce explica prezenta unui sistem de duble legaturi conjugate, cu o grupare -OH enolizabila.Este usor solubila in apa si metanol, greu solubila in alcool etilic, acetona si glocerina si insolubila in eter , hidrocarburi alifatice si aromatice.

Principala proprietate a acidului ascorbic este caracterul sau puternic reducator, adica usurinta cu care se poate oxida.Reprezinta cel mai puternic agent reducator din tesuturi.Cresterea metabolizarii vitaminei C produce sporirea oxalatului si a uratilor din urina.

Surse de vitamina C

Vitamina C este cea mai raspandita vitamina din natura. Se gaseste atat in zarzavaturi cat si in citrice, sursa naturala principala constituind-o macesele in care se gaseste impreuna cu asa-numitele flavonide care sporesc efectele acidului asboric.

In sucul fructelor citrice o buna parte din acidul ascorbic este combinata cu unii aminoacizi, vitamina PP si alte substante.In cantitate mai mare, acidul ascorbic se gaseste in fructele citrice (lamai, portocale, mandarine, rodii),macese, coarne, coacaze negre, fructe de catina, nuci necoapte, frunze, mere.Continutul acidului ascorbic variaza la plantele furajere tinere intre 4,25-5,66mg∕g, iar la cele mature intre 0,7-1,1mg∕g .Cerealele au un continut de acid ascorbic mult redus.

Un continut ridicat in acid ascorbic il au glandele suprarenale, hipofiza, ficatul, rinichii.In suprarenalele de bou, acidul ascorbic se gaseste in cantitate de 150-270mg%, iar la porc de 90-200mg%. Continutul mediu de vitamina C al unor alimente raportat la 200g aliment:brocoli 90mg, lamai 53mg, portocale 50mg, coacaze negre 177mg, macese 1250mg, ardei 139mg.

Produsele vegetale pierd prin pastrare o cantitate insemnata de acid ascorbic.In cazul pastrarii acestora la temperaturi scazute, degradarea vitaminei C este minima. Cartofii prin pastrare la temperatura camerei pierd aproximativ 15% din continutul vitaminei C la fiecare luna, iar prin fierbere decojiti pierd 30-50%.

Rolul vitaminei C

Vitamina C are un rol multiplu si complex in organismele animale si vegetale.Ea are un rol esential in formarea si mentinerea integritatii colagenului, in hematopoieza si metabolismul fierului, influenteaza activitatea deferitelor sisteme enzimatice cu rol fundamental in metabolismul glucidelor, lipidelor, protidelor, a aminoacizilor aromatici ,hormonilor steroidici, in biosinteza si functionarea acizilor folici.

Are de asemenea un rol deosebit de important in reactiile de oxidoreducere, din organism, in activitatea creierului, ficatului, glandelor endocrine, in metabolismul acizilor grasi, a colesterolului si a acizilor biliari, mareste imunitatea organismului si rezistenta la infectii, previne formarea unor substante cancerigene, inclusiv a nitrozaminelor in stomac.Vitamina C are un rol important in calcifierea dintilor, in cresterea tonusului muschilor netezi si in scaderea contractibilitasii muschilor striati.Mareste rezistenta organismelor la oboseala, frig, infectii, intoxicatii.Are rol important in biosinteza hormonilor steroidici sexuali si corticosuprarenali.Vitamina C are efecte favorabile in tratarea alergiilor,intoleranta la unele medicamente pentru mamrirea rezistentei organismului la infectii,intoxicari,agenti poluanti,agenti mutageni si cancerigeni.

Vitamina H (biotina)

Biotina este o vitamina importanta pentru om,majoritatea animalelor si pentru numeroase microorganisme.In decursul timpului biotina a fost denumita bios II,bios II B,factorul X, factorul W , vitamina B₈,vitamina H,coenzima R,denumiri vechi scoase din actuala nomenclatura ,avand doar o semnificatie istorica.Cu toate ca se cunosc opt forme de biotina, numai D-biotina se gaseste larg raspandita in natura si prezinta activitate vitaminica.Reprezinta un extract total de drojdii, practic un amestec de substante, care stimuleaza cresterea drojdiilor, a unor ciuperci si a numeroase microorganisme. Denumirea de vitamina H atribuita biotinei, s-a datorat proprietatii acesteia de a impiedica intoxicarea animalelor cu ou crud si de a proteja pielea,fiind numita si vitamina de protectie a pielii.

Sub aspect structural se cunosc doua biotine naturale,cu activitate vitaminica, numite α- si β-biotina.Ele sunt substante izomere cu aceeasi formula moleculara C₁₀H₁₆O₃N₂S, dar se deosebesc prin punctul de topire, activitatea optica si structura catenei laterale.

Biotina extrasa din ou se numeste α-biotina , iar cea extrasa din ficat β-biotina.

Ambele biotine au o structura complexa, fiind formate prin condensarea unui heterociclu imidazolic,cu un ciclu tiofenic,la care se gaseste o catena laterala de acid valerianic pentru β-biotina si respectiv acid izovalerianic pentru α-biotina.Ambele biotine contin o grupare carboxilica libera,un ciclu pirimidinic cu 2 atomi de azot,un ciclu tiofenic cu un atom de sulf,care provin dintr-o legatura tioeterica.

fig.2.10. Structura moleculara a biotinei.

Proprietati fizico-chimice

Biotina se prezinta sub forma de cristale aciculare incolore,cu puncte de topire diferite pentru α- si β-biotina, α-biotina are punctul de topire la 230sC,iar unghiul de rotatie a luminii monocromatice de (+)51s, β-biotina are punctul de topire la 232-233sC in mediu bazic(NaOH 0,1n).Biotina libera este usor solubila in apa calda si in solutii bazice diluate.

Biotinele sunt inactivate de catre baze alcaline si acizi tari, sub actiunea carora se transforma in sulfoxizi sau sulfone.Biotina are caracter de acid slab.Biotina are capacitatea de-a se uni cu proteine si peptide ,formand complexe stabile , neabsorbite prin intestin.

Surse de vitamina H

Biotina este una din vitaminele cele mai raspandite in produsele alimentare naturale,neprelucrate industrial.Galbenusul de ou,rinichii,ficatul,drojdiile,cojile cerealelor,carnea de morun,reprezinta surse importante de biotina.

In plante,cu exceptia boabelor de cereale si a nucilor, biotina se gaseste predominant in stare libera, solubila in apa, in timp ce in carne, drojdii, nuci, cojile cerealelor se gaseste predominant sub forma de complexe proteice,insolubile in apa.Continutul de biotina din galbenusul de ou este de 300μg∕100g, in ficat de porc si vaca de 250μg∕100g, in drojdia de bere de 7 μg∕100g, mazare verde 1,1 μg∕100g, struguri 3,5μg∕100gContinutul biotinei din plantele furajere uscate este de 16-40 μg∕100g,iar in fructe intre 0,01 si 19 μg∕100g.In timpul prepararii alimentelor,continutul de biotina scade cu aproximativ 20%,dar in acelasi timp prin fierberea si prajirea alimentelor,proteinele se degradeaza si nu pot forma cu biotina complexe naebsorbabile, rezistente la actiunea enzimelor hidrolitice din tubul digestiv.

Rolul vitaminei H

Vitamina H are un rol important in cresterea si functionarea normala a organismelor animale si vegetale.Are un rol cheie in metabolismul glucidelor, lipidelor si al proteinelor, precum si in metabolismul energetic celular. Are de asemenea un rol insemnat in stimularea biosintezei vitaminei C.

Biotina contribuie la biosinteza acidului oleic.Are un rol biochimic multiplu,putand sa catalizeze reactii de carboxilare,decarboxilare,dehidrogenare si dezaminare,in functie de sistemul enzimatic in care este inclusa.

III .CONTRIBUTII ORIGINALE

3.1.SCOP SI OBIECTIVE

Am ales drojdia de bere datorita proprietatilor sale antianemice, antitoxice, stimulante, remineralizante etc. intareste sistemul imunitar si combate bolile infectioase. Favorizeaza asimilarea alimentara si este un catalizator pentru substantele hidrocarbonate. Combate tulburarile digestive: constipatie, diaree, colite. Este foarte eficienta in avitaminoze, denutritie, slabiciune. Ajuta la crestere, rahitism, sportivilor le mareste rezistenta la oboseala, favorizand travaliul muscular si usurand eliminarea de toxine.

Scopul acestei lucrari a fost

In primul rand stabilirea unui protocol HPLC de separare a vitaminelor hidrosolubile din complexul vitaminic B, utilizand diferite sisteme de eluare si diferite metode de extractie a acestor compusi.In acest sens s-au testat trei sisteme de separare a vitaminelor ,dintre care s-a ales unul singur pentru experimentele urmatoare.

In al doilea rand s-a incercat separarea vitaminelor hidrosolubile din drojdia de bere de fermentatie primara si secundara,deoarece aceasta matrice este bogata in acesti compusi.

3.2. MATERIALE

Babilonienii au fost primii oameni care au fabricat bere din boabe de orz macinate si tot ei au fost primii care au descoperit efectele benefice asupra pielii ale sedimentelor din ulcioarele de fermentatie, cu alte cuvinte efectele benefice ale drojdiei de bere.

Raspindirea berii in Egipt, Etiopia, Europa, a insemnat si descoperirea altor beneficii pe care le poate oferi drojdia de bere. Hipocrate recomanda drojdia de bere ca diuretic, iar in Evul Mediu, era utilizata in scopul prevenirii leprei.

Abia in secolul al XIX-lea, drojdia de bere a inceput sa fie prescrisa de catre medici pentru combaterea furunculozei, revigorarea organismului la adulti sau copiilor anemici.

Babilonienii aveau o zeita a berii si a drojdiei de bere, Nidaba, recunoscuta prin puterile ei terapeutice. Egiptenii si celtii foloseau drojdia de bere pentru prepararea bauturilor slab alcoolizate, dar cunosteau si actiunile benefice ale acesteia asupra tenului si a pielii in general.

Mai tirziu, Pliniu, marele naturalist roman, povesteste ca Hipocrate, celebrul medic grec, ar fi descoperit, in jurul anului 370 i.e.n, actiunea diuretica a drojdiei de bere, pe care o recomanda ca remediu. In Evul Mediu, calugarii care ii supravegheau pe leprosi luau drojdie de bere in scop preventiv. Era folosita si contra scarlatinei si rujeolei .

Tab.3.1. Aportul enegetic al drojdiei de bere comparativ cu diferite produse alimentare

Caldura mare si lumina duc la degradarea drojdiei. In stare cruda, drojdia de bere contine o combinatie perfecta de substante nutritive: 50 % proteine, 30 % glucide, 5 % lipide, toti acizii indispensabili vietii, diastaze, mult gluten si peptide (cu actiune preponderenta in fenomenele vitale, in reactiile de oxido-reducere, in dezintoxicare), lecitina sau grasimi fosfarate, zaharuri, saruri minerale, vitamine.

Termenul de vitamine a fost introdus in 1912 de Casimir Funk, pentru a denumi anumiti microfactori ai alimentelor, necesari pentru viata. Denumirea vitaminelor s-a facut initial cu majuscule si/sau printr-o nomenclatura care descria functia pe care o indeplineau, denumirea corecta este in prezent cea corespunzatoare structurii lor chimice, desi varianta cu litere este adeseori preferata deoarece ea poate grupa diversi compusi, asa cum este cazul vitaminelor din complexul B sau al majoritatii vitaminelor liposolubile.

Toate vitaminele B sunt necesare inmultirii si functionarii normale a celulelor.Din grupa sau complexul vitaminelor B fac parte vitaminele B₁, B₂, B₆, B₁₂, acidul pantotenic (vitamina B5) , nicotinamida (vitamina B₃), vitamina H (vitamina B₈,biotina), colina.

Dupa rolul si activitatea lor biologica, vitaminele din complexul B se pot clasifica in:

• Vitamine de crestere (vitaminele B₁ si B₂)
• Vitaminele dermatrope (vitamina PP pentru om, B₆ pentru sobolani, acidul pantotenic pentru pasari)
• Factori de crestere a microorganismelor  (biotina, vitamina H)
• Antiaminice (vitamina B₁₂, acizii folici si folinici)

Pentru vitamina B₁ se poate folosi ca metoda de analiza si metoda fluorimetrica, care se bazeaza pe masurarea fluorescentei tiocromatului in lumina ultravioleta.Tiocromul se obtine prin oxidarea vitaminei B₁ cu K₃[Fe(CN)₆] si alti oxidanti stabili in solutie alcalina(pH 10),iar la lumina ultravioleta prezinta o fluorescenta albastra.La 1 ml solutie de vitamina B₁ se adauga 0,5 ml fericianura de potasiu 2%,1 ml sol. NaOH 30% si 1 ml solutie de butanol.Dupa ce se agita continutul acestora se pune eprubeta in lumina ultravioleta si se observa ca stratul alcoolic prezinta o intensa fluorescenta albastra,care dispare prin acidulare si reapare la alcanizare.

In afara de metoda fluorimetrica, se mai poate utiliza,ca metoda de analiza, si metoda spectrofotometrica.Aceasta se bazeaza pe determinarea spectrului de absorbtie a vitaminei B₁ care in lumina ultravioleta prezinta un maxim la 265 nm.In solutie de NaOH 4% vitamina B₁ da un maxim de absorbtie instabil la 340 nm.

Dintre metodele fizice de analiza,pentru analiza vitaminei B_2,sunt frecvent utilizate metodele spectrofotometrice.Ele se bazeaza pe inregistrarea spectrului de absorbtie care prezinta maxime de absorbtie la 445, 372, 369 si 225 nm,caracteristice riboflavinei.Se mai utilizeaza si metodele cromatografice pe coloana,in strat subtire sau pe hartie .

Acidul nicotinic prezinta in solutie apoasa un spectru de absorbtie caracteristic,cu maxime de absorbtie la 237-262 nm.

La analiza cu ajutorul metodelor spectrofotometrice. vitaminele B₆ prezinta spectre de absorbtie caracteristice, avand absorbtia maxima la 291 nm in UV si in solutie de HCl 0,1N, in solutie tampon la pH 7 prezinta maxime de absorbtie la 254 si 324nm.

Acidul folic se poate determina fluorimetric in urma transformarii sale intr-un compus fluorescent,prin oxidare cu KMnO₄ si iradiere cu lumina UV,avand maxim de absorbtie la 265 nm.

Vitaminele B₁₂ se pot identifica prin metode fizice, chimice,biologice si microbiologice.

Dintre metodele fizice o utilizare mai mare o au metodele spectrofotometrice si cele polarimetrice.Vitamina B₁₂ prezinta in solutie, maxime de absorbtie la 278, 361 si 550 nm.

Cele mai utilizate metode fizice de analiza pentru vitamina C sunt cele spectrofotometrice, polarometrice, fotometrice, cromatografice si radiometrie.In solutii slab acide,vitamina C are un maxim de absorbtie la 254 nm,iar in solutii alcaline la 265 nm.

Metodele fizice si chimice sunt putin utilizate pentru identificarea biotinei.Uneori se folosesc metode polarografice,cromatografice si spectrofotometrice, in reactia cu 4-dimetilaminobenzaldehida.

3.3 METODE DE ANALIZA

Spectrometria de absorbtie in UV-VIS

Una dintre primele metode instrumentale aparute si utilizate frecvent in practica

laboratoarelor de analize chimice din zilele noastre este metoda bazata pe absorbtia luminii din domeniul vizibil (domeniu notat in literatura internationala VIS). Se cunosc mai multe variante importante pentru aceasta metoda: colorimetria, fotometria si spectrofotometria.

Colorimetria, una dintre tehnicile extrem de mult utilizate in practica analitica,

reprezinta varianta in care intensitatea culorii probei se compara vizual sau instrumental, in lumina alba, cu un set de solutii etalon - preparate in conditii absolut identice cu proba.

Aceasta este o metoda subiectiva si mai putin selectiva, pentru ca rezultatele depind mult de persoana care executa analiza. Se remarca faptul ca sensibilitatea maxima a ochiului omenesc atinge maximul pentru domeniul 550-560 nm (domeniul culorii verzi), lucru important cand compararea probei cu etalonul se face vizual. In aceasta tehnica se pot realiza masuratori, prin comparatie vizuala, chiar in eprubeta la lumina zilei, rezultand analize chimice cu exactitati mai slabe decat 1%. Cu cat exista mai multe solutii etalon, pentru comparatie, cu atat metoda este mai exacta.

Exista, dupa cum am amintit si metode colorimetrice instrumentale, obiective, dar acestea sunt tot mai putin folosite. In schimb se folosesc aparate ieftine care utilizeaza metode colorimetrice bazate pe reactii executate pe hartie de filtru, pe substante aflate in stare adsorbita pe suporturi granulare - in cazul gazelor - si chiar pe reactii de culoare in solutii.

Fotometria si spectrofotometria masoara instrumental lumina transmisa de o solutie colorata lucrand cu o sursa de lumina monocromatica. Cand lumina incidenta este filtrata, prin filtre optice, avand un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie iar cand domeniul filtrat este mai ingust (utilizand monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie. In ultima varianta, este posibila fixarea mai precisa a lungimii de unda la care se lucreaza.

Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de absorbtie, adica o curba, obtinuta prin masurarea semnalului in functie de lungimea de unda a radiatiei incidente. In literatura de specialitate uneori se foloseste pentru ambele metode si denumirea de metoda colorimetrica (sau chiar spectrocolorimetrica), ceea ce uneori poate crea confuzii. In domeniul UV, ochiul omenesc nepercepand lumina, se utilizeaza doar spectrofotometria.

Intrucat principiile sunt identice iar aparatele sunt in multe privinte similare in cele doua domenii, in ultimul timp, in afara de aparatele dedicate domeniului VIS sau a celor pentru UV, de multe ori se utilizeaza un singur instrument pentru ambele intervale de lungimi de unda, ceea ce a dus la denumirea din titlu.

Constructia instrumentelor are in general doua variante anume spectrofotometrele monocanal, cu un singur drum optic si cele comparative, prevazute cu doua canale. In spectrometrele comparative printr-o singura masuratoare, proba etalon cu cea de analizat se compara utilizand doua radiatii care-si au originea in aceeasi sursa (coerente).

Se observa (fig. 3.1.) ca radiatia incidenta, monocromatica, realizata cu ajutorul

monocromatorului M, trece prin cuveta cu proba, C, unde intensitatea scade fata de situatia in care in locul probei de analizat se pune o asa-numita proba martor (sau proba oarba) - o proba de referinta de concentratie zero.

Apoi fascicolul cade pe detectorul D, unde semnalul optic este transformat in semnal electric. Semnalul rezultat, dupa o amplificare, poate fi in final masurat si inregistrat.

Inregistrat nu mai inseamna astazi intotdeauna preluarea semnalului cu un inregistrator ci mai degraba introducerea acestuia in memoria unui calculator urmand de regula prelucrarea automata a datelor.

fig.3.1.Redarea schematica a unui spectrofotometru de absorbtie cu elementele sale componente

Materialele din care se confectioneaza diferitele parti componente ale spectrofotometrelor sunt prezentate in tabelul 3.1.

Tab.3.1. Componentele unui spectrofotometru de absorbsie in vizibil si ultraviolet

Se poate remarca faptul ca detectorii sunt identici iar cuva de cuart permite lucrul in ambele domenii. Doar sursele difera. Prin inglobarea ambelor surse - lampa cu deuteriu si cea cu wolfram - in acelasi instrument, functionand consecutiv, s-a reusit realizarea spectrofotometrelor UV-VIS.

Legea Lambert - Beer

Aceasta lege reprezinta legea de baza folosita in analizele sau determinarile spectrofotometrice.Sa consideram o radiatie incidenta monocromatica, Io, care cade pe o celula continand proba. Celula are lungimea l iar concentratia substantei ce absoarbe lumina, C. Conform schitei din fig.3.2., intensitatea finala, I, este mai mica decat cea initiala, Io in urma absorbtiei luminii, la trecerea prin celula.

Fig.3.2.Absorbtia luminii an cazul legii Lambert-Beer

Daca lungimea l provoaca o reducere cu un anumit procent a intensitatii initiale, Io, de

exemplu cu 50%, un nou strat de lungime l, egala cu primul, va actiona, conform legii Lamber- Beer, in acelasi mod, adica va diminua tot la jumatate noua radiatie incidenta.

Forma cea mai utilizata dar si cea mai simpla a legii Lambert - Beer este:

A = εlC

Coeficientul molar de extinctie reprezinta absorbanta unei solutii de concentratie 1 mol/l daca lungimea celulei cu proba este 1 cm. Legea este riguros respectata doar pentru o radiatie monocromatica. Deci, cu cat filtrul optic este mai ingust, ca domeniu spectral, cu atat liniaritatea dreptei se respecta pe un domeniu mai larg de concentratii.Dar un filtru cu domeniu spectral ingust lasa sa treaca putina lumina si performantele metodei sunt conditionate si de performantele detectorului.

In general, peste nivele de concentratie de 10-2 mol·L^-1 curba de etalonare isi modifica panta (de regula aceasta scade).

De aceea, metoda este adecvata mai ales pentru solutii diluate si nu este o metoda potrivita pentru analize de componente majore (adica substante aflate in concentratii de peste 10%) din orice fel de probe.

Spectre de absorbtie

Spectrele de absorbtie reprezinta dependenta semnalului de lungimea de unda, λ.Exista mai multe variante de prezentare dar cea mai utilizata este varianta reprezentarii absorbantei in functie de lungimea de unda: A = f(λ). Celelalte variante, mai putin utilizate -numite toate spectre de absorbtie - sunt T = f(λ), log A = f(λ), ε = f(λ) sau log ε = f(λ).

Ultimele doua servesc in special pentru caracterizarea speciilor moleculare intrucat nu mai depind de conditiile experimentale in care se fac determinarile acestor spectre.

Fiecare substanta are un spectru de absorbtie caracteristic, ca forma generala, ca domeniu spectral, ca numar de maxime (denumite picuri) precum si ca raporturi intre intensitatile diverselor picuri. Pozitia picului este caracterizata de valoarea sa maxima, λmax . Se numeste maxim de absorbtie atat varful ca atare cat si lungimea de unda care corespunde maximului. Pot exista unul sau mai multe maxime de absorbtie. Numarul de maxime precum si forma generala a curbei, reprezinta caracteristica calitativa dupa care se pot identifica substantele.

Analiza chimica calitativa se bazeaza pe compararea spectrelor de absorbtie ale substantelor sau materialelor in domeniul UV-VIS, adica 180-1100 nm cu spectre cunoscute.

Acest procedeu permite identificarea unui anumit numar de specii chimice, dar numai pentru acele substante care absorb in acest domeniu. In chimia organica, de exemplu, absorb in acest domeniu perechile de electroni de valenta angajati in legaturi σ si π precum si perechile de electroni neparticipanti. Pentru ca in cursul acestor tranzitii apar modificari ale polaritatii legaturii respective, aceste spectre au primit numele de spectre cu transfer de sarcina. Fiecare tranzitie are asociata o lungime de unda caracteristica (unde va aparea un maxim) si un coeficient molar de absorbtie, ε, corespunzator. Acestea se datoreaza unor "salturi" ale electronilor de valenta, adica a electronilor situati pe straturile exterioare ale atomilor angajati in legaturi chimice.

In substantele formate din molecule covalente se cunosc asa-numitele grupari cromofore sau auxocrome, care sunt grupari de atomi care dau intregii molecule calitatea de a absorbi lumina - in cazul de fata, in domeniul UV-VIS. O grupare cromofora reprezinta locul din molecula unde-si au originea tranzitiile electronice. S-a mai introdus si termenul de cromogen care constituie ansamblul dintr-un schelet molecular pe care se gasesc grefati mai multi cromofori. Pentru o serie de molecule, toate avand legate acelasi cromofor, pozitia si intensitatea benzilor de absorbtie raman in mare aceleasi. Mai mult, daca o molecula contine mai multe grupe cromofore izolate, mai exact separate intre ele prin cel putin doua legaturi simple, se poate observa suprapunerea efectelor individuale.

Sursele luminoase cele mai obisnuite utilizate in domeniul UV-VIS, sunt lampa cu

incandescenta prevazuta de obicei cu filament incandescent de W - deosebindu-se de becurile

electrice obisnuite prin aceea ca zona de iesire a radiatiei este confectionata din sticla de cuart

- si lampa cu deuteriu prevazuta cu arc de descarcare in deuteriu, aflat la o presiune medie

(ceea ce asigura un spectru continuu). Un spectrometru prevazut cu ambele surse, poate acoperi tot domeniul UV-VIS.

Instrumentatia

Asa cum s-a aratat, orice spectrofotometru reprezinta o reuniune de 4 parti componente distincte: (1) sursa, (2)sistemul dispersiv sau monocromatorul, (3) detectorul si(4) inregistratorul.

Ultimul, poate fi un simplu dispozitiv de citire a rezultatului inregistrarea facandu-se manual. Exista o gama foarte larga de spectrofotometre, deosebirea constand in domeniul de lungimi de unda acoperit, in puterea de dispersie a monocromatorului, in natura detectorului, in mediul optic traversat sau chiar in principiul de constructie al instrumentului in ansamblu.

Sursele luminoase cele mai obisnuite utilizate in domeniul UV-VIS, sunt lampa cu incandescenta prevazuta de obicei cu filament incandescent de W - deosebindu-se de becurile electrice obisnuite prin aceea ca zona de iesire a radiatiei este confectionata din sticla de cuart - si lampa cu deuteriu prevazuta cu arc de descarcare in deuteriu, aflat la o presiune medie (ceea ce asigura un spectru continuu). O astfel de lampa, a carui punct de descarcare este zona cenusie din interiorul cutiei mari,permite obtinerea unui spectru continuu pe domeniul 160-400nm, care se completeaza foarte bine cu spectrul becului cu incandescenta. Un spectrometru prevazut cu ambele surse, poate acoperi tot domeniul UV-VIS. Razele de lumina trec prin aer, dar mai nou dirijarea acestora se face si prin fibre optice.

Sistemul dispersiv sau monocromatorul poate fi, in vizibil, un filtru colorat din sticla sau material plastic transparent dar si un filtru cu interferenta, iar in UV-VIS o prisma confectionata din cuart sau, in ultimul timp, sisteme bazate pe retele plane sau concave cu circa 1200 trasaturi per mm. Aceste retele sunt integrate in monocromatoare care permit extragerea unei zone inguste din spectrul UV-VIS, printr-o simpla deplasare a oglinzii .

Latimea domeniului spectral care trece prin monocromator depinde mult de latimea fantelor de intrare si iesire. Cele mai bune rezolutii se obtin prin utilizarea unor oglinzi prevazute cu distante focale mari (0.2-0.5m). Detectorul transforma semnalul luminos in semnal electric.

Acest dispozitiv da asadar un semnal proportional cu intensitatea care iese din celula de masura. Intensitatea semnalului receptionat va depinde de lungimea de unda - deci de lungimea de unda selectionata prin pozitia oglinzii - dar si prin deschiderea fantelor de intrare, respectiv de iesire, din monocromator.

Acestea din urma, limiteaza domeniul spectral dar si intensitatea luminii, in ansamblu. De aceea fiecare modificare de deschidere a fantelor sau de lungime de unda modifica si intensitatea masurata de spectrofotometru.

De-a lungul timpului s-au impus doua tipuri de detectori: tuburile fotomultiplicatoare si dispozitivele semiconductoare (care pot fi, la randul lor, detectori cu transfer de sarcina -CCD , in l. engl.- sau fotodiode cu siliciu - CID).

Fotomultiplicatoarele sunt niste dispozitive ultrasensibile al carui domeniu liniar se intinde pe 7 decade si care au fost pana nu demult cele mai utilizate. Pentru spectrofotometrele de rutina, fotodiodele sunt cele mai utilizate. In ultimul timp au aparut detectoarele cu retelele de diode care constituie de fapt niste diode de dimensiuni mici insirate pe aceeasi placa. In acest caz nu mai este nevoie de fanta de iesire, ceea ce a simplificat intrucatva instrumentatia (fig.3.3.).

fig.3.3.reprezentarea schematica a unui spectrofotometru cu retea de diode

fig.3.4.schema bloc a unui spectrofotometru monocanal.Prin proba(3) se intelege atat proba de analizat ,cat si cea de referinta

Spectrometrele monocanal, a caror schema bloc este prezentata in fig. 14, sunt cele mai utilizate in aplicatiile de rutina. De regula in calea razei incidente se plaseaza succesiv proba martor sau de referinta (care contine solventul plus eventual reactivii necesari pentru analiza) si proba de analizat.

Spectrometrul cu retea de diode care are avantajul ca permite receptia simultana a intregii game spectrale intr-un interval de timp decateva milisecunde.

Spectrometrele bazate pe comparatie (cu dublu canal) sunt cele mai performante spectrofotometre cunoscute. In acestea, dupa despartirea razei incidente, monocromatice in doua fascicule, una dintre acestea traverseaza proba iar alta, simultan sau secvential, traverseaza celula de referinta care contine proba martor.

Spectrometria fotoacustica

O varianta indirecta a spectrometriei de absorbtie nu masoara lumina absorbita de

catre proba ci schimbarea starii termice a acesteia in urma procesului de absorbtie. In fond

este tot o masuratoare indirecta a luminii absorbite, cu singura deosebire ca marimea masurata

nu este una optica.

Modificarea ce are loc in proba nu este doar termica, ci termodinamica, adica sunt

implicati toti parametrii legati de temperatura, de exemplu, presiunea sau densitatea probei.

Metodele fotoacustice fac apel tocmai la modificarile de presiune sau de densitate ale probei

ca urmare a absorbtiei luminii. De aceea nu are importanta daca gazul, lichidul sau solidul

supus masuratorii provoaca o modificare a directiei luminii din drumul optic, de exemplu

contine neomogenitati sau particule opace (fum, ceata, pulberi in suspensie etc.), precizia

metodei ramanand neafectata.

Cu ajutorul acestei tehnici, solutiile de coloranti pot fi analizate pe domenii liniare de

circa 10 ori mai largi decat masurand absorbanta optica la aceeasi lungime de unda (de ex.

la 523nm ) si s-au pus la punct metode pentru analiza fumului rezultat din motoarele

Diesel (lucrandu-se la 800nm). De asemenea, s-a mai constatat ca semnalul creste liniar cu

energia pulsului de energie a radiatiei laser.

3.3.2. Spectrometria de absorbtie in IR

Domeniul infrarosu (IR) al spectrului undelor electromagnetice contine radiatii cu lungimi de unda cuprinse intre 0.8 si 1000 μm.

La ora actuala se cunosc si se aplica un grup de metode de analiza chimica care valorifica semnalele obtinute prin absorbtia radiatiilor din acest domeniu. Domeniul amintit, poate fi divizat la randul sau in trei subdomenii: IR apropiat (intre 0.8 si 2.5μm), IR-mediu (intre 2.5-25μm) si IR-indepartat (peste 25μm).

Domeniul mediu se mai numeste si IR fundamental. Acesta este cel mai bogat in informatii si cel mai accesibil experimental. In vorbirea obisnuita este domeniul IR care serveste in mod curent atat pentru analiza chimica cat si pentru recunoasterea calitativa a combinatiilor anorganice, organice sau naturale dar si in determinari de structura chimica.

Domeniul IR apropiat, destul de sarac in benzi de absorbtie specifice anumitor legaturi, are o importanta mare tocmai in aplicatii cantitative ale lichidelor. Domeniul IR indepartat este inca in studiu.

Exista la ora actuala o diversitate de metode de analiza bazate pe spectrele IR. Astfel

exista spectrometre bazate pe dispersie dupa lungimea de unda, sau bazate pe transformata Fourier, diverse analizoare industriale simple, nedispersive - ultimele specializate doar pe anumite combinatii chimice - precum si spectrometre de proces care fac analize, in mod continuu, pe anumite linii tehnologice de gaze sau lichide. In fine, exista spectrometre IR portabile care permit analiza unor poluanti ai mediului.

Absorbtia in IR se datoreaza interactiunilor dintre radiatia electromagnetica incidenta si anume componenta electrica a acesteia, cu dipolii electrici ai unei molecule. Se admite astazi ca energia radiatiilor IR provoaca o amplificare a energiei de vibratie a moleculelor datorita faptului ca dipolul corespunzator legaturii oscileaza cu o frecventa apropiata cu cea a componentei electrice amintite. Amintim ca intr-o molecula, in mod natural, atomii componenti executa miscari de vibratie de-a lungul legaturii in timp ce molecula se roteste.

O intensificare a miscarii de vibratie duce la o alungire si simultan, la o slabire a legaturii dar si la o intensificare a miscarii de rotatie. In acest fel se explica de ce, in absenta oricarui dipole permanent, nu apare nici un cuplaj cu unda electromagnetica si nu are loc nici o diminuare a intensitatii radiatiei IR incidente.

Sau, altfel spus, gazele monoatomice (gazele rare) si substantele cu moleculele simetrice (ca de exemplu O_2, N₂, Cl₂)_, avand legaturi nepolare, sunt perfect transparente la radiatiile din domeniu IR. In moleculele poliatomice posibilitatile de aparitie ale spectrelor IR sunt mai mari deoarece aici vibratiile asimetrice pot duce, chiar in moleculele nepolare, la aparitia unor dipoli electrici, iar posibilitatile de aparitie ale unor vibratii de deformare (de modificare a unghiurilor dintre legaturi in afara celor de alungire) se maresc.

Pe de alta parte, intensitatea unei benzi de absorbtie in IR este proportionala cu patratul variatiei momentului dipolar al moleculei, datorita absorbtiei. Se stie ca in general grupele polare (C-O, C=O, C-Br etc.) genereaza benzi de absorbtie mai intense decat cele slab polare (C-N, C=N, C-H etc.).

Se mai stie din studiul fizic al spectrelor ca energia mecanica totala, a unei molecule

izolate, poate fi aproximata printr-o reuniune de trei termeni (toti cuantificati) -corespunzand energiilor de rotatie, de vibratie si a electronilor de legatura - care se poate reda prin ecuatia:

Despre miscarea de vibratie am amintit cate ceva in aliniatele precedente. Energia de rotatie se refera la rotatia moleculei in jurul centrului de greutate si valorile cu care variaza aceasta energie sunt cu mult mai mici decat in cazul vibratiei, care la randul ei este mai mica decat cea a electronilor de legatura.

Acestia din urma interactioneaza in special cu radiatia din domeniul UV-VIS. Cei trei termeni, care apar adesea simultan in spectre, sunt foarte diferiti ca valoare energetica si se poate considera ca cei trei variaza independent unii de altii.

Aceasta aproximatie este posibila pe baza teoremei Born - Oppenheimer, care permite o abordare simplificata a problemei .

Miscarea de vibratie a unei legaturi dintr-o molecula poate sa fie asimilata unei deplasari asemananatoare cu un arc spiral - situat in directia legaturii. Miscarea ritmica a acestuia, de-a lungul legaturii, duce la cresterea, respectiv scurtarea distantei interatomice.

Totodata, poate sa ia si aspectul unei deformari (sau indoiri) a legaturii, care implica deplasarea atomilor in afara axei dintre acestia. Numarul mare de legaturi duce implcit la un numar mare de benzi.

Amintim de asemenea, ca experimental nu s-au observat spectre de linii pentru compusi in fazele condensate (lichida sau solida), in schimb sunt frecvente astfel de linii in faza gazoasa. Motivele sunt tocmai interactiunile dipol-dipol, dintre molecule aflate in faza condensata, precum si solvatarea reciproca intre acestea, lucru care implica, foarte probabil, perturbatii ale nivelelor energetice ale legaturilor chimice individuale.

Pe de alta parte, largirea unei linii este invers proportionala cu durata starii excitate. Aceasta durata fiind mai scurta in starile condensate, liniile spectrale IR ale lichidelor si solidelor se largesc suplimentar, predominand benzile de absorbtie.

fig.3.5. Cele doua tipuri de vibratii a unei legaturi covalente polare implicate in absorbtie IR

Aparatura

Primele instrumente comerciale pentru domeniul IR au aparut inca din anii 1940.Diversitatea extraordinara de aparate utilizate astazi in cele mai diferite domenii se poate

impartii in trei categorii:

Fotometre nedispersive bazate pe filtre simple formate uneori chiar din gazele de analizat.Aceste pot fi monocanal sau comparative.

Spectrometre bazate pe dispersia luminii (folosind prisme sau monocromatoare bazate pe difractie si interferenta) si care pot fi prevazute cu doua canale sau monocanal (cu sau fara chopper).

Spectrometre bazate pe transformata Fourier, care permit intrarea in celula a intregului domeniu spectral si care sesizeaza interferometric liniile caracteristice de absorbtie. Aceste instrumente, datorita unei rezolutii mai bune si a rapiditatii, datorate cuplarii cu calculatorul, in ultimul timp au devenit preferate.

3.3.3.Cromatografie

Cromatografia este o metoda fizico-chimica moderna, considerata nu doar o metoda de

separare, in majoritatea variantelor ea prezinta o metoda analitica hibrida, care imbina separarea cu

identificarea ulterioara si dozarea componentilor depistati in amestecurile complexe.

Conform aprecierii expertilor, cromatografia se considera una din cele 20 descoperiri

importante ale secolului XX, care au contribuit cel mai mult la reformarea stiintei, iar prin prisma ei

se determina nivelul de dezvoltare al industriei si tehnicii, civilizatiei in intregime . Totodata,

prezinta o ramura a analizei instrumentale cu un larg spectru aplicativ in majoritatea domeniilor si

nici o metoda analitica nu concureaza cu cea cromatografica, la momentul dat, dupa aplicarea

universala si eficacitatea separarii celor mai compuse amestecuri.

Primele descrieri ale procesului de separare sunt intalnite in lucrarile chimistului german Runge

de prin anul 1850 si ale altor savanti, dar in fine ei n-au reusit sa formeze o disciplina stiintifica. Fondatorul metodei cromatografice se considera Mihail Tvet, botanic si chimist rus, dotat cu

anul 1903, care a efectuat primele incercari de separare in domeniul colorantilor vegetali pe o

coloana de oxid de aluminiu .

In multe surse literare se intalneste anul 1906, unde pentru prima

data in articolul autorului M. Tvet apare termenul "cromatografie", in care se dezvaluie conceptul

"experienta cromatografica".

Etapa importanta in cercetare, in 1938, a devenit descrierea cromatografiei pe strat subtire de

savantii N. A. Izmailov si M. S. Shraiber, metoda care astazi are o raspandire universala, datorita

unui cost redus, a vitezei mari de eluare si a rezolutiei lejere.

Bazandu-se pe fenomenul deja cunoscut, descris in lucrarile lui M. Tvet, si aplicandu-l in cazul

aminoacizilor, in 1941 savantii englezi A. D. Martin si R. Synge au elaborat metoda cromatografica

de repartitie, pentru care in 1952 au fost decernati cu premiul Nobel. In timpul cercetarilor, aceiasi

savanti si colegii lor Consden, Gordon au depistat ca in afara de silicagel, apa este retinuta si de celuloza. Astfel in 1944 a fost elaborata o noua metoda cromatografica − pe hartie, utilizandu-se ca

sorbent al fazei stationare hartia de filtru.

Un mare succes al savantului Martin in colaborare cu E. T. James a urmat de asemenea in anul

1952 cu punerea bazelor cromatografiei de gaze (GC), apoi in 1959 savantul Golay a introdus

notiunea cromatografia de gaze pe coloane capilare. Metoda data este larg raspandita si pana in

prezent .

In timp cromatografia de lichide s-a dezvoltat datorita perfectionarii detectorilor, pompelor si ca rezultat s-au construit cromatografe de lichide de performanta inalta (HPLC). Cu aparitia

metodei HPLC (an. 1968) autorii Giddings si Kirkland au propus utilizarea unor faze stationare cu

particule foarte mici, cu trecerea fazei mobile sub presiune .

Un aport colosal la dezvoltarea cromatografiei au depus si savantii A. V. Kiseliov, A. A.

Jucovski, C. I. Sacadinscki, destinsi cu medalia internationala M. Tvet "Pentru descoperirile

distinse in domeniul cromatografiei" si multi alti specialisti in acest domeniu .

Cromatografia ca metoda de separare se incadreaza in grupul de procedee bazate pe migrarea

diferentiata a componentilor din amestecul studiat dintre doua faze, adica migrare diferentiata a

diferitor molecule .Ea cerceteaza starea termodinamica a sistemelor dintre

doua faze, studiaza natura interactiunii intramoleculare, cinetica proceselor interne si schimbului de

masa intre faze, proceselor formatoare de complecsi, asociatii si multe altele.

Datorita complexitatii proceselor de separare, subintelegerii deosebit de multilaterale a

termenului "cromatografie" este dificila formularea unei definitii generale. Insa se poate spune ca

toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o "faza stationara" si o "faza mobila", iar

componentii amestecului de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza mobila

(gazoase sau lichide), cu viteze diferite, ceea ce constituie principiul fundamental al separarii. Pe de

alta parte, la baza majoritatii metodelor cromatografice de separare stau patru procese

fundamentale: adsorbtia pe suporturi solide, repartitia intre faza stationara si aceea mobila, schimbul

ionic si de excluziune. Astfel, principiul separarii poate fi diferit, dar etapele analizei

cromatografice sunt aceleasi.

Luand in consideratie cele expuse, totodata si numerosii factori implicati in separare, in asigurarea selectivitatii si rezolutiei, precum si caracteristicile detectorilor utilizati, respectiv de sensibilitatea lor, reproductibilitatea proceselor de separare, detectie si dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzatoare.

De aceea cromatografia se poate clasifica: avand in

vedere natura fazelor stationara si a celei mobile (in faza gazoasa, lichida si faza supercritica); in

functie de procesele fizico-chimice care stau la baza separarii (cromatografie de adsorbtie, de

repartitie, de schimb ionic, de excluziune, cu formare de perechi de ioni, de afinitate); in functie de

modalitatea de imobilizare a fazei stationare (cromatografie pe coloana si planara); in functie de

starea fizica a celor doua faze (cromatografie gaz-lichid, gaz-solid, lichid-lichid, lichid-solid) si

altele .

Pozitia privilegiata a cromatografiei se datoreaza faptului ca la baza migrarii se gaseste

repetarea echilibrului de repartitie dintre doua faze (stationara si mobila), care pentru un singur

proces se poate realiza extrem de rapid, de repetate ori intr-un interval de timp scurt .

1.2. Etapele analizei cromatografice

Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul carei depinde de designarea

optima si scrupulozitatea efectuarii fiecarei etape in parte. Se pot evidentia 3 etape de baza ale

acestui proces:

Prepararea probelor - toate operatiile de preparare a mostrelor de analizat, care se finiseaza cu

obtinerea probelor, injectate direct in coloana cromatografica, inclusiv si derivatizarea precoloana,

in caz de utilizare.

Analiza cromatografica propriu zisa - din momentul injectarii probei pana la inregistrarea

semnalului electric la iesirea din detector, inclusiv si derivatizarea pe coloana sau postcoloana, unde

ea este prezenta.

Prelucrarea informatiei cromatografice primare, rezultatul careia consta in obtinerea

marimilor ce caracterizeaza componenta calitativa si cantitativa a probelor de analizat.

Oricare din etapele enumerate are specificul sau de realizare si cere o tratare individuala de

optimizare. In lucrarea data problemele optimizarii fiecarei etape vor fi examinate coerent, insa ne

vom abate putin de la cronologia obisnuita si vom examina optimizarea separarii cromatografice in

ultimul rand. Schimbarea este legata de faptul, ca pentru a patrunde in esenta principiilor optimizarii

selectivitatii de separare in general si a metodelor model in particular mai intai este necesar de a

examina parametrii de baza a semnalelor cromatografice si algoritmii lor de prelucrare.

O atentie aparte trebuie acordata problemei de compatibilitate intre etape, care persista intr-o

forma vadita sau nevadita permanent. Si daca problema compatibilitatii algoritmilor de prelucrare a

informatiei cu parametrii semnalelor cromatografice se rezolva de obicei de developeri de program

si de aparataj, fapt care exista pentru analitic intr-o forma nevadita, pe cand asigurarea

compatibilitatii probelor preparate cu sistemul cromatografic se extinde pe umerii celor ce

elaboreaza metodele analitice. In fond asigurarea acestei compatibilitati si este una din sarcinile

etapei de preparare a probelor. Aceasta inseamna ca optimizarea prepararii probelor si conditiilor

separarii cromatografice sa nu se execute separat, dar in contextul unui proces unic. Astfel,

utilizarea variantei cromatografie de adsorbtie necesita inlaturarea completa a apei din componenta

mostrelor de analizat, in cazul cromatografiei cu faza inversa, din contra, trebuie inlaturati solventii

organici nepolari; schimbarea tipului detectorului poate sa ceara excluderea unor componenti din

faza mobila si din probele de injectat. In unele cazuri chiar si schimbarea componentei fazei mobile

necesita corectarea metodei de preparare a probelor.

Analiza lucrarilor publicate denota faptul ca, autorii, in majoritatea cazurilor, rezolva

problemele date satisfacator, dar, cu regret, ele se discuta rar, ce duce la subestimarea semnificatiei

lor nu doar de incepatori, dar si de unii cercetatori cu experienta.

Cromatografia grupeaza o variata si importanta grupa de metode care permit cercetatorului sa separe compusi foarte asemanatori din amestecuri complexe. In toate separarile cromatografice proba este dizolvata intr-o faza mobila: gaz, lichid sau fluid supercritic. Aceasta faza este frecvent numita eluent, iar dupa ce trece de capatul coloanei se numeste eluat.

Metoda cromatografica a fost descoperita de botanistul rus Mihail Tswet, in 1906 si a fost folosita intai pentru separarea unor substante colorate pe coloana sau ca eluate colorate. Daca substantele sunt incolore, prezenta lor pe coloana sau in eluate se recunoaste prin alte metode .

3.3.3.1.Clasificarea metodelor cromatografice

Metodele cromatrografice pot fi clasificate in functie de :

faza stationara si mobila,

performanta tehnica

mecanismele de separare.

Faza stationara este o substanta sau amestec de substante solide, un film subtire sau lichid aplicat pe suprafata unui suport solid prin legaturi chimice. Faza stationara este o pulbere fina, are porozitate si o suprafata specifica mare. Dimensiunile particulelor depind de varianta tehnica aleasa.

Exemple de faze stationare: silicagelul, oxidul de aluminiu, oxidul de magneziu, carbonatul de calciu, hidroxidul de calciu. Utilizat ca atare, acest tip de suport a folosit la separarea pe baza unui proces de adsorbtie diferentiat pe diferitele componente din amestec. Acest tip de suport defineste cromatografia cu faza directa.

Faza stationara poate fi impregnata prin legarea chimica a unor derivati nepolari ai silanului, si anume, octasilanul si octadecilsilan. Acest tip de suport cu faza inversa este bazat pe procesul de repartitie a componentelor intre faza stationara nepolara si faza mobila si se numeste separare cu faza inversa.

Faza mobila sau eluentul au rolul de a realiza deplasarea diferentiata a componentelor amestecului, in functie de solubilitatea lor in eluent si de afinitatea componentelor pentru faza stationara.

Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorbtia amestecului de substante (solid-lichid; lichid-lichid; gaz-lichid) pe un material adsorbant, urmata de desorbtia succesiva (cu ajutorul unui dizolvant adecvat - eluant) a componentelor din amestec.

Coloana de adsorbant poate fi inlocuita, in unele variante cu o foaie de hartie poroasa preparata in mod special (cromatografie pe hartie) sau cu un strat subtire de adsorbant fixat pe o placa de sticla, cu ajutorul unui liant (cromatografie in strat subtire).

Separarea compusului de analizat de potentialele interferente este unul din pasii esentiali in analiza chimica.

Cromatografia este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru a realiza aceste separari analitice. Aplicatiile cromatografiei cresc exponential cu timpul, in mare parte datorita faptului ca ea isi gaseste aplicatii in toate ramurile stiintei. Este rapida, simpla, cu costuri relativ reduse si variabilitate mare relativ la alegerea metodei de separare.

O analiza cromatografica se rezuma in general la urmatoarele concepte fundamentale:

. proba este dizolvata in faza mobila;

. faza stationara este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafata unor particule de solid utilizate pentru a impacheta coloana;

. faza mobila este trecuta peste faza stationara nemiscibila; aceasta se numeste elutie;

. solutul care are o mare afinitate fata de faza mobila se va misca prin coloana foarte incet;

. componentii probei se vor separa in benzi discrete vizibile la detector, si rezulta cromatograma.

Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asemanatoare. Ea poate fi de asemenea utilizata pentru determinari cantitative si calitative ale speciilor separate.

In termeni de informatie calitativa, o cromatograma furnizeaza timpul de retentie al speciilor sau pozitiile acestora pe faza stationara dupa un timp de elutie specific. Cromatografia poate fi extrem de utila pentru recunoasterea prezentei sau absentei unor componenti in amestec ce contine un numar limitat de specii cunoscute. Confirmarea identitatii serveste si pentru alte investigatii, si nu in ultimul rand cromatografia serveste ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice.Dupa performanta tehnica si tipul de suport, cromatografia poate fi: cromatografie pe coloana deschisa si cromatografie pe coloana inchisa, iar in functie de faza stationara sau sistemul experimental folosit la separare, cromatografia pe coloana se subclasifica in:

Cromatografia pe coloana deschisa:

- cromatografia pe hartie;

- cromatografia pe strat subtire;

- cromatografia pe coloane deschise de sticla;

Cromatografia pe coloana inchisa:

- cromatografia de gaze pe coloane de sticla sau metalice,normale sau capilare;

- cromatografia de lichide pe coloane de sticla sau de otel, la presiuni joase (FPLC) sau inalte (HPLC).

Separarile pe hartie si strat subtire se bazeaza pe fenomenul de capilaritate, eluentul se deplaseaza prin porozitatea suportului. Separarile pe coloana dechisa de sticla se fac sub presiune atmosferica, sub presiuni mai mari decat cea atmosferica sau sub vid. Cele mai performante separari se fac pe coloane de otel inchise, unde eluentul este deplasat sub presiuni mari. Aceasta tehnica a primit numele de cromatografie lichida sub presiune inalta (HPLC).

Dupa mecanismul de separare, cromatografia se calasifica in: cromatografie de adsorbtie, de repartitie lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune sterica sau de afinitate.

Informatia cantitativa este principalul motiv pentru care cromatografia are o atat de larga folosinta. Ea se bazeaza pe compararea mai multor inaltimi sau suprafete ale picurilor analitice cu etaloane. Analiza bazata pe aria picurilor, care este independenta de efectele de deformare este mult mai precisa si de aceea mult mai comuna.

Oricum, toate datele cantitative sunt dependente de prepararea standardelor si calibrarile succesive ale coloanei folosind aceste standarde.

Fara exactitate si calibrare precisa a datelor, nici o data cromatografica nu poate fi considerata exacta.

Sunt 5 categorii de cromatografii:

1. de adsorbtie;
2. de partitie;
3. cu schimb de ioni;
4. prin excluziune moleculara;
5. de afinitate.

Metodele de cromatografie pot fi de asemenea clasificate in doua moduri:

• cromatografia planara
• cromatografia pe coloana.

Ele sunt bazate pe interactiunea fizica, ceea ce inseamna ca faza stationara si faza mobila sunt in contact. In cromatografia pe coloana, faza stationara este introdusa in interiorul unui tub ingust si faza mobila este introdusa in tub cu ajutorul presiunii sau a greutatii proprii.

In contrast, cromatografia plana foloseste o faza stationara care este depusa pe o suprafata plana sau in hartie. Faza mobila se deplaseaza prin faza stationara datorita actiunii capilare sau a greutatii .

Cromatografia de lichide, gaze si de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate atat pe tipurile de faze mobile si stationare cat si tipurile de echilibre implicate in transferul solutului intre faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide si fluide supercritice. Fazele stationare variaza si tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze.

Cromatografia de adsorbtie utilizeaza o faza stationara solida si o faza mobila care este un lichid sau un gaz. Solutul poate fi adsorbit la suprafata particulelor solide, unde echilibrul dintre starea adsorbita si solutie produce separarea moleculelor solutului.

In cromatografia de partitie faza stationara este un film subtire pe suprafata unui suport solid. Solutul stabileste un echilibru intre lichidul stationar si faza mobila (lichida sau gazoasa).

In cromatografia de schimb ionic anionii sau cationii sunt legati covalent de o faza stationara solida, frecvent o rasina sau o faza solida tare si amorfa. O faza mobila lichida este utilizata. Ionii solutului de sarcina opusa sunt atrasi de faza stationara datorita fortelor electrostatice.

Cromatografia de excluziune moleculara este mai comun denumita de gel permeabil sau de filtrare cu gel. Aceasta tehnica separa moleculele dupa marime si moleculele mari trec cu o viteza mai mare decat moleculele mici. Nu exista interactiuni atractive. In loc, faza mobila gazoasa sau lichida este trecuta printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu si pe cele mici. Moleculele mari curg peste fara a intra in gel, si ele elueaza primele .

Cromatografia de afinitate este bazata pe interactiunea intre un tip de molecule de solut si un al doilea tip, acestea legate covalent de faza stationara. Cand un amestec este trecut prin coloana, doar un tip de molecule de solut reactioneaza cu moleculele legate si formeaza legaturi la rasina. Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind pH-ul sau taria ionica a solventului .

Cromatografia de gaze, lichide si pe strat subtire

In cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat cu ajutorul unei pompe de cauciuc intr-un port injector, care vaporizeaza proba.

Probele gazoase pot fi injectate folosind o siringa adecvata. Un gaz inert purtator poarta proba prin coloana ce contine faza stationara.

Gazul purtator serveste ca faza mobila. Dupa traversarea coloanei, particulele separate de solut intra intr-un detector.

Raspunsul este afisat pe un calculator ca functie de timp.

Fig.3.6. schema principalelor etape in cromatografia de gaze

In figura 3.7. este ilustrata structura coloanei de separare, intr-o perspectiva din sectiune

si constructia unei coloane de separare.

Fig.3.7.. Sectiune prin coloana de separare si constructia sa toroidala in GC

Figura 3.8. ilustreaza asamblarea partilor componente ale unei instalatii de cromatografie de gaze.

fig.3.8. aparatura pentru cromatografia de gaze

In cromatografia pe strat subtire (TLC), un spot de proba este aplicat peste o bucata de hartie sau sticla avand faza stationara impregnata. Capatul suprafetei de hartie sau sticla este apoi scufundata intr-o cantitate de solvent, care serveste ca faza mobila. Solventul migreaza de-a lungul fazei stationare,

separand componentii probei in lungul drumului sau (fig.3.9.). 

Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC) refera noile proceduri de cromatografie de lichide bazate pe o instrumentatie sofisticata .

Fig.3.9.Faze inTLC

Cand solventul ajunge in vecinatatea partii superioare, este inlaturata cantitatea suplimentara de solvent si este lasat sa se usuce.

Cativa dintre componentii probei sunt vizibili in acest moment .

Alte masuratori sunt in mod curent efectuate pentru a detecta toti componentii probei .

Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare (fig. 3.10.).

Fig.3.10. Schema Bloc a HPLC

Detectie

Foarte multe detectoare sunt angajate in separarile cromatografice . Detectia absorbantei moleculare UV-VIS este cea mai comuna. Detectorul ideal este necesar sa aiba: sensibilitate adecvata; buna stabilitate si reproductibilitate; timp de raspuns scurt; raspuns liniar la diferite ordine de concentratie; stabilitate pe un larg domeniu de temperatura; durata lunga de viata si usurinta in utilizare.

Monocromatorul este adesea o componenta a instrumentului UV-VIS. El permite scanari spectrale, ceea ce inseamna capacitatea de a varia lungimea de unda a radiatiei in mod continuu intr-un domeniu larg.

Fantele monocromatorului joaca un rol important. Fanta de intrare serveste ca sursa de radiatie. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determinari cantitative in care detaliul spectral este important, in comparatie cu analiza calitativa.

Metode de prelucrare a informatiei cromatografice

Metoda standardului intern furnizeaza cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativa deoarece ea elimina incertitudinile introduse de simpla injectie. In aceasta metoda, o cantitate exact masurata de substanta este adaugata fiecarui standard sau probe. Standardul intern trebuie sa fie ales astfel incat el sa se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei.

De asemenea, picul standard trebuie sa fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substanta din picul de standard intern serveste apoi ca parametru analitic.

Metoda normalizarii ariilor este o alta aproximare utilizata pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injectie. In aceasta metoda, aria tuturor picurilor complet eluate este calculata.

Concentratia analitica este gasita ca raport al ariei de pic la aria totala a tuturor picurilor.

Largimea benzii in cromatografie

O cromatograma:

. ilustreaza raspunsul detectorului la un compus de analizat din proba la iesirea acestuia din coloana ca functie de timp sau de volum de faza mobila adaugata;

. este utila atat pentru determinarile cantitative cat si calitative;

. furnizeaza o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizeaza informatia cantitativa despre cantitatea de component iar pozitia picului serveste pentru identificarea compusului din proba;

Cateva forme de banda pe cromatograma este posibil sa depinda de concentratia compusului de analizat in fazele mobila si stationara si de comportamentul fiecarui compus in parte (fig.3.11.).

fig.3.11.Forme de picuri-(a)Gaussian, (b)deplasat dreapta, (c)deplasat stanga

Un pic Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum picurile pot avea o crestere progresiva urmata de o cadere abrupta datorata supraincarcarii coloanei (b) sau o forma cu coada care rezulta din faptul ca unele lacase ale coloanei retin solutul mai mult decat altele (c).

Largimea benzii poate fi explicata din punct de vedere cantitativ.

O particula individuala suporta multe transformari in timpul migrarii, in consecinta, timpul de stationare in coloana este extrem de diferit precum si migrarea particulelor de-a lungul coloanei este neregulata. Odata cu cresterea timpului, latimea benzii creste in timp ce se parcurge coloana, timpul de stationare in coloana va fi mai mare, iar viteza de curgere a fazei mobile scade .

Exista patru parametri care caracterizeaza in general viteza de migrare: timpul de retentie, coeficientul de partitie, factorul de capacitate si factorul de separare. Acesti parametri descriu echilibrul de distributie care exista si implicit, transferul solutiei in cele doua faze (fig.3.12.).

fig.3.12.Elementele unei cromatograme

Timpul t_R la care apare maximul unui pic, masurat din momentul introducerii probei se numeste timp de retinere sau retentie si este o caracteristica calitativa a componentului respectiv. Inaltimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici cantitative, proportionale cu cantitatea componentului din proba. Se noteaza cu t_M timpul in care eluentul si componentele care nu interactioneaza cu faza stationara parcurg distanta pana la detector.

Astfel putem exprima viteza componentului din faza stationara (v) si a eluentului (u) prin urmatoarele ecuatii:

v = L/t_R

u = L/t_M

unde L este lungimea coloanei.

3.3.3.2.Cromatografia lichida de inalta performanta (HPLC)

Aceasta tehnica a devenit cea mai performanta in analiza chimica, biomedicala si diagnostic de laborator. Este utilizata pentru separarea si detectia unor compusi biologic activi, instabili termic, in concentratii extrem de mici, cu o viteza si precizie mult marite in raport cu metodele clasice amintite mai sus.

Partile componente ale unui cromatograf de lichide de inalta performanta (HPLC) si modul de functionare.

Este format din doua pompe atasate la un rezervor de unde preiau eluentl, un injector de introducere a probei, o coloana de separare atasata la un detector care identifica componentele pe baza unei proprietati, in ordinea iesirii din coloana si un inregistrator care vizualizeaza cromatograma.

Separarea poate avea scop analitic si atunci are loc pe o coloana de otel de dimensiuni mici sau preparativ, pe coloane de dimensiuni mai mari. Proba este injectata in coloana printr-un sistem de injectie special construit atasat la o pompa care trimite solventul de eluare a coloanei cu o presiune mare. Debitul de curgere depinde de aceasta presiune si este, de obicei, cuprinsa intre 0,2 si 2 ml/min. Uneori, pentru o separare mai performanta, elutia se poate face cu amestecuri de solventi a caror concentratie variaza in timp, si aceasta necesita utilizarea a doua pompe si a unei camere de amestecare.

Faza stationara. In functie de umplerea coloanelor exista HPLC:

v    cu faza normala (NP-HPLC), in care faza stationara este polara: silicagel, alumina, celuloza;

v    cu faza inversa (RP-HPLC), in care faza stationara este nepolara de tip octadecilsilan sau octasilan.

Mecanismul pe baza caruia are loc separarea in aceste cazuri este diferit, daca pentru sistemele NP-HPLC, separarea are la baza adsorbtia diferita a componentelor amestecului pe faza stationara, pentru sistemele RP-HPLC, procesul de separare are la baza repartitia componentelor amestecului intre faza stationara nepolara si eluentul polar.

Tipul fazei mobile este dependent de natura fazei de stationare, astfel:

• in sistemele cu faza normala unde faza stationara este polara se folosesc eluenti nepolari;
• iar unde faza stationara este nepolara, in sistemele cu faza inversa se folosesc amestecuri de solventi polari, cum sunt: acetonitrilul, metanolul, acetatul de etil, apa.

In functie de tipul probei de analizat se alege unul din aceste sisteme:

daca proba este preponderent nepolara se recomanda utilizarea sistemului NP-HPLC unde coloana contine faza stationara polara cu afinitate diferita pentru moleculele nepolare, care vor fi primele eluate, cu solventul preponderent nepolar;

daca proba este preponderent polara, se recomanda utilizarea sistemului RP-HPLC, cu faza stationara nepolara si afinitate diferita pentru moleculare polare, ce vor fi eluate primele, cu solventi polari.

Detectia componentelor separate din amestec se face prin metode fizico-chimice, de obicei, cu ajutorul unor spectofotometre UV-VIS, cu detectori conductometrici, electrochimici sau refractometrici. Acestia preiau continuu fluxul de solvent continand componentele separate pe coloana si transforma semnalul chimic in semnal electric, inregistrat sub forma unei cromatograme. Un tip de detector cu performanta inalta, introdus recent in uz, este detectorul de tip PDA, care are posibilitatea sa inregistreze concomitent absorbtiile fiecarei componente la toate lungimile de unda baleiate.

Exista situatii cand substantele structural diferite au aceiasi timpi de retentie, deci nu pot fi separate. In acest caz, este necesara schimbarea unor parametri cromatografici. Eficienta separarii nu este caracterizata numai de diferentele dintre valorile t_k , ea depinde si de latimea picului, conform formulei

R=2(t_R2-t_R1/w₁+w₂),

iar semnificatia termenilor este urmatoarea:

R-rezolutie

t_R-timpi de retentie

w-latimea picurilor

T    daca doi picuri au latimea mare (w), ele se suprapun si rezolutia R scade. Daca t₀ reprezinta timpul de retentie al frontului fazei mobile, cu cat curgerea pe coloane HPLC este mai lenta si coloana este mai lunga, timpul t₀ este mai mare. In consecinta, t_k este dependent de lungimea coloanei si de viteza de curgere a eluentului. Pentru a calcula factorul de capacitate k', se utilizeaza formula:

k'=t_k-t₀/t₀

De regula, factorul k' sa fie cuprins intre 1 si 5, pentru o separare performanta.

Figura 3.13. Diagrama sistemului HPLC

Figura 3.14. Sistem HPLC

3.4. REZULTATE SI DISCUTII

Asa cum este cunoscut ,vitaminele B sunt factori metabolici si regulatori esentiali,necesari in sanatatea si cresterea umana. Masuratorile cantitative precise ale vitaminelor din mancare sunt folositoare ca cerinta necesara de introducere suficienta a vitaminelor.

Luand in considerare lipsa unor asemenea vitamine ,prezenta lor in prepararea mancarii trebuie sa fie verificata pentru a se asigura alimentarea corecta si precizia celor scrise pe eticheta.

Pierderea de vitamine in mancare se poate datora tehnologiei de fabricare si depozitarii.

Tabelul nr.3.2. prezinta principalele caracteristici ale 5 vitamine hidrosolubile reprezentative din grupa B .

Tabelul nr.3.2. Structurile chimice,activitatile biologice primare si dozele zilnice recomandate de vitamine hidrosolubile (grupa B)

Tehnicile noi, ca si cromatografia lichida de inalta performanta (HPLC) care are legatura cu diferite detectari, sunt instrumente analitice de seama pentru identificarea,separarea si cuantificarea vitaminelor din complexul B, cat si pentru atti analiti datorita posibilitatii lor de separare si cuantificare precisa.

Analiza vitaminelor B a fost realizata in general pe amestecuri pure, tablete, formule farmaceutice, dar si pe produse de consum. Luand in considerare faptul ca vitaminele sunt legate de structurile supramoleculare complexe ca proteinele in mancare,extragerea lor din matricele de hrana complexe si analiza lor devine dificila.

Am dezvoltat si optimizat proceduri diferite pentru extragerea ,separarea si identificarea a 5 vitamnine B,cum ar fi:acidul nicotinic(vit.B₃), piridoxina(vit.B₆), acidul folic, cianocobalamina(vit.B₁₂) si riboflavina(vit.B₂) gasite in produsele de drojdie de bere.

3.4.1.Analiza HPLC a vitaminelor B din drojdia de bere

La analiza HPLC a vitaminelor B din drojdia de bere s-a folosit:

• un cromatograf lichid de inalta performanta(HPLC Szimatsu) cuplat la un detector PDA.
• Solventii organici de gradul HPLC ,cum ar fi metanolul si acetatul de amoniu .
• Apa folosita ca eluent pentru analiza a fost filtrata de un sistem Millipore.

Toate vitaminele hidrosolubile :acid nicotinic,piridoxina,acidul folic,cianocobalamina si riboflavina au fost achizitionate ,indeplinind standardul de puritate.

Pregatirea solutiilor standard si curbele

Solutiile de stoc apoase (1,2 mg/ml) ale fiecarei vitamine au fost pregatite in fiecare saptamana,pastrate in frigider,intr-o folie de aluminiu,ferite de lumina si concentratiile luate in lucru au fost intre 0,15mg/ml-1,2 mg/ml .

Curbele standard au fost realizate prin introducerea a minim 4 concentratii ale fiecarei vitamine intr-un sistem HPLC.

3.4.1.1.Separarea si identificarea vitaminelor hidrosolubile din drojdia de bere prin metoda HPLC

Experimentele au fost efectuate in Laboratoarele Disciplinelor de Chimie si Biochimie din cadrul catedrei V TPPA.

Pentru separarea celor 5 vitamine B a fost utilizata o coloana C18 Restek Ultra Aqueous(250× 4,6 mm, 5µm) , iar separarea a avut loc la temperatura camerei.

Faza mobila a constat din 0,05 M CH₃COONH₄/CH₃OH (99/1) (solvent A) si H₂O/CH₃OH (50/50) (solvent B) cu o viteza de 0,8 ml/min. Volumul de injectie a fost de 20 µL .

In vederea obtinerii unei cat mai bune separari ale vitaminelor hidrosolubile s-au incercat trei sisteme de faze mobile in diferite proportii volumetrice.

Primul sistem (I) a folosit solventii A:B (99/1) si a fost eluat izocratic timp de 4 minute, apoi a crescut liniar pentru a atinge procentul din solventul B timp de 18 min. In cele din urma elutia a fost din nou izocratica timp de 8 minute.

Intre injectari s-a pastrat un timp de echilibrare de 5 minute. Al doilea sistem(II) a inceput cu aceeasi compozitie A: B (99/1) ,izocratic pentru 3 minute, apoi solventul B a crescut liniar pana la 100% ,timp de 12 min si in cele din urma izocratic timp de 10 min.

Al treilea sistem (III) a inceput la A:B (99/1) izocratic timp de 3 min ,apoi solventul B a crescut liniar pana la 100%, timp de 10 min si a scazut liniar pentru a atinge 100% A timp de 3 min .

Detectia PDA a fost monitorizata la 265 nm pentru riboflavina, 260 nm pentru acidul nicotinic si piridoxina , 230 nm pentru cianocobalamina si 280 nm pentru acidul folic.

Identificarea picurilor caracteristice fiecarei vitamine a fost realizata prin compararea spectrelor lor cu cele rezultate din solutiile standard.

Optimizarea separarii HPLC a 5 vitamine B folosind standarde pure

Dupa testarea celor 3 protocoale de separare (I-III) rezultatele optime cu picuri simetrice bine separate a vitaminelor B individuale au fost obtinute pentru sistemul II.

Fig. 3.4.1. reprezinta cromatograma HPLC-PDA a standardelor mixte (vitaminele B₁, B₃, B₆, B₂ si acidul folic) continand 1,2 mg/ mL din fiecare vitamina.

Fig.3.4.1. Cromatograma HPLC amestecului de standarde pure al vitaminelor la 260 nm

Tabel nr.3.3.absorbtia maxima spectrala specifica si timpul de retentie pentru 5 vitamine B

La inceput analiza HPLC a fost realizata folosind solutii standard individuale si apoi standarde mixte asa cum sunt prezentate in Fig.3.16.

S-a ales lungimea de unda cea mai potrivita pentru a obtine detectarea si separarea lor simultana, deoarece proprietatile lor spectrale difera foarte mult.

Pentru aceeasi concentratie, datorita coeficientului molar de absorbtie individual diferit intensitatea picului a fost diferita la 260 nm, cea mai buna absorbtie fiind pentru acidul folic si cea mai scazuta pentru vitamina B₁₂.

De aceea au fost testate cele mai bune lungimi de unda pentru fiecare absorbtie a vitaminelor in gamele de raze spectrale ale UV (190-400 nm) pentru detectarea vitaminelor B₃, B₆, acid folic si B₁₂ potrivit timpului lor de retentie si a caracteristicilor lor spectrale dupa cum s-a aratat in tabelul 3.2.

3.4.1.2. Analiza HPLC a vitaminelor din tablete de drojdie de berendizolvate in apa si extractele hidrolizate

In acest studiu au fost folosite doua tipuri de drojdie de bere proaspata: drojdie de bere de fermentatie primara (PF) si drojdie de bere de fermentatie secundara (SF).

Ambele au fost pastrate la temperature de 8˚C si au fost scoase afara chiar inaintea inceperii experimentului pentru a evita contaminarea si reducerea activitatilor sale enzimatice.

Mostrele de tablete de drojdie de bere au fost si ele analizate, fie ca extract in apa sau dupa hidroliza acida sau bazica

Hidroliza mostrelor a fost realizata in hidroxid de sodiu(NaOH) 1N (hidroliza alcalina) sau in acid tricloracetic 5% (TCA) (hidoliza acida) timp de 1 ora, 6 ore si 24 ore la inceput la temperatura camerei si mai apoi la 50˚C .

Dupa hidroliza vitaminelor pH-ul a fost ajustat la 6,8 folosind NaOH 1N in faza mobila si cu HCl 1N dupa hidroliza alcalina. Inaintea injectarii mostrele au fost centrifugate si filtrate cu ajutorul filtrelor Teknokroma(0,2 µm

Fig.3.4.2. (A si B) prezinta cromatograma HPLC a extractului tabletei de drojdie de bere in apa la temperature camerei (A) si dupa hidroliza acida sau alcalina (B).

Cand a fost folosita apa ca si extractant ( fig.3.4.2. A) , cromatograma a fost foarte complexa si dificil de identificat, numai una din vitamine (in forma libera) poate fi identificata, aceasta fiind vitamina B₃..Pentru a determina continutul total de vitamina, prin eliberarea vitaminelor din complecsii cu proteine, extractia a fost facuta dupa hidroliza acida sau alcalina.

Rezultatele bune au fost obtinute in cazul extractelor cu NaOH 1N (hidroliza alcalina) , acid tricloracetic 5% la 50˚C (hidroliza acida) timp de o ora ,asa cum este aratat in fig. 3.4.2.B.

O comparatie intre fig.3.4.2.A si fig.3.4.2.B indica faptul ca cea mai buna separare cromatografica a vitaminelor B a fost obtinuta cand tabletele de drojdie de bere au fost extrase in conditii alcaline.

In continuare sunt prezentate cromatogramele obtinute in urma analizelor facute.

Fig.3.4.2.A. Cromatograma HPLC a vitaminelor libere si altor componente din tableta de drojdie de bere extrasa in apa

Dupa cum se observa din cromatograma singura vitamina care poate fi pusa in evidenta comparativ cu cromatograma standardelor este vitamina B₃. Acest lucru demonstreaza ca dintre toate cele cinci vitamine analizate numai aceasta se gaseste in stare libera si poate fi identificata in urma dizolvarii probei in apa. Celelalte vitamine se gasesc legate de alte componente biochimice, cel mai adesea de glucide , de aceea identificarea lor necesita o hidroliza prealabila.

Tabel 3.3.timpul de retentie al vitaminelor din extractul tabletei de drojdie in apa

Fig.3.4.2.B. Cromatogramele comparative ale extractelor acide, respective alcaline din drojdia de bere

Tab.3.4. Timpii de retentie a vitaminelor din extractul tabletei de drojdie dupa hidroliza alcalina

Comparand cele doua cromatograme se observa absorbtii mult mai intense in cazul tabletei de drojdie hidrolizata alcalin fata de cea hidrolizata acid, ceea ce demonstreaza faptul ca primul tip de hidroliza este mai eficient pentru aceste vitamine.In cazul acidului folic hidroliza acida nu este eficienta, ceea ce inseamna ca nu a fost separate de complecsii in care se gaseste in drojdie. Acelasi lucru se poate afirma si in cazul vitaminelor B₁₂ si B₂ , la care absorbtiile sunt foarte mici, iar picurile cromatografice slab reprezentate.

Fig.3.4.3.Cromatograma vitaminelor din drojdie (fermentatie secundara) obtinuta prin hidroliza alcalina la 257 nm

Fig.3.4.4.Cromatograma vitaminelor din drojdia (fermentatie secundara) obtinuta prin hidroliza alcalina dupa 1h si 50˚C (257nm)

Se observa si in cazul acestei hidrolize o separare eficienta a celor cinci vitamine, dar deosebirea fata de hidroliza alcalina anterioara nu este prea mare asa cum ar fi fost de asteptat avand in vedere ca in acest caz s-a marit timpul de hidroliza si temperatura .

Fig.3.4.5. Cromatograma vitaminelor din drojdia (fermentatie secundara) obtinuta prin hidroliza acida la 24h

Hidroliza acida a fost ineficienta, la fel ca si in cazul tabletelor de drojdie. Dupa cum se poate observa din cromatograma doua dintre vitamine n-au putut fi puse in evidenta ceea ce inseamna ca nu s-au hidrolizat in aceste conditii.

De asemenea s-au efectuat analizele spectrale ale celor cinci vitamine pentru confirmarea timpului de retentie. Analizele de spectre sunt prezentate in figurile urmatoare:

Analiza spectrala a vitaminei B₃

Analiza spectrala a vitaminei B₆

Analiza spectrala a vitaminei B₉

Analiza spectrala a vitaminei B₁₂

Analiza spectrala a vitaminei B₂

Analizele spectrale ale picurilor cromatografice corespunzatoare celor cinci vitamine confirma faptul ca in probe au fost identificate aceste componente.

Hidroliza alcalina a dat cele mai sigure date, fiind detectate toate vitaminele,exceptand acidul folic(fig.3.4.2.B).

. Comparatia amprentelor HPLC ale drojdiei de bere provenita din PF si SF.

Mostrele PF si SF au fost hidrolizate si identificarea tuturor celor 5 vitamine potrivit cromatogramelor lor HPLC sunt aratate in fig.3.4.3.

Amprentele extractelor din drojdia de bere arata o buna aemanare intre cromatogramele suprapuse. Diferentele au fost observate la intensitatile picurilor, mai inalte in cazul extractului de drojdie de bere PF. Vitaminele B₃ au avut cele mai intense semnale urmate de acidul folic si vitamina B_6.

Vitaminele B₁₂ si B₂ cu picurile foarte scazute indica cantitati mici in extractul PF si numai urme in extractul de drojdie de bere SF.

Identificarea vitaminelor s-a bazat pe absorbtia maxima a spectrului lor, pe timpul lor de retentie si confirmat de co-cromatografia mostrelor cu standarde pure.

Fig.3.4.3.. Cromatogramele HPLC caracteristice a PF si SF dupa hidroliza alcalina.

In ambele cazuri au fost identificate cele cinci vitamine, ceea ce demonstreaza ca aceste vitamine se gasesc atat in drojdia de fermentatie primara, cat si secundara.

3.5.CONCLUZII SI RECOMANDARI

In aceasta lucrare au fost optimizate protocoalele pentru separarea HPLC a 5 vitamine B solubile in apa : acid nicotinic, piridoxina, acid folic, cianocobalamina si riboflavina ca solutii standard pure, folosind un protocol original si optimizat.

Aceleasi vitamine au fost analizate diferit , fiind extrase in apa,acid sau hidrolizate alcalin.

Extractele in apa contin cantitati mici de vitamine libere (in principal vitamina B₃), ceea ce sugereaza faptul ca aceste vitamine se gasesc sub forma de complecsi cu alte substante si necesita hidroliza pentru a fi identificate. Extracte hidrolizate au dat amprente complexe si diferite.

Prin dizolvare in apa singura vitamina care poate fi pusa in evidenta comparativ cu cromatograma standardelor este vitamina B₃. Acest lucru demonstreaza ca dintre toate cele cinci vitamine analizate numai aceasta se gaseste in stare libera si poate fi identificata in urma dizolvarii probei in apa. Celelalte vitamine se gasesc legate de alte componente biochimice, cel mai adesea de glucide , de aceea identificarea lor necesita o hidroliza prealabila.

In cazul tabletelor de drojdie, comparand cele doua cromatograme se observa absorbtii mult mai intense in cazul tabletei de drojdie hidrolizata alcalin fata de cea hidrolizata acid, ceea ce demonstreaza faptul ca primul tip de hidroliza este mai eficient pentru aceste vitamine.In cazul acidului folic hidroliza acida nu este eficienta, ceea ce inseamna ca nu a fost separat de complecsii in care se gaseste in drojdie. Acelasi lucru se poate afirma si in cazul vitaminelor B₁₂ si B₂ , la care absorbtiile sunt foarte mici, iar picurile cromatografice slab reprezentate.

Pentru drojdia de fermentatie secundara se observa o separare eficienta a celor cinci vitamine in cazul hidrolizei alcaline.

Hidroliza acida a fost ineficienta, la fel ca si in cazul tabletelor de drojdie. In urma analizelor s-a constatat ca doua dintre vitamine n-au putut fi puse in evidenta ceea ce inseamna ca nu s-au hidrolizat in aceste conditii. Extractul hidrolizat acid a fost sarac in vitamine in timp ce extractul alcalin a continut toate cele 5 vitamine intr-o concentratie mare.Vitaminele B₃ au dat picuri majore in comparatie cu acidul folic si B₆ si vitaminele B₁₂ si B₂ cu semnale foarte slabe.

In general, vitaminele B au fost intr-o concentratie mai mare in extractul drojdiei provenita de la fermentatia primara fata de cel al drojdiei de extractie secundara.

Se recomanda optimizarea separarii HPLC si pentru celelalte vitamine hidrosolubile si a protocolului de hidroliza acida in vederea imbunatatirii separarii acestor compusi.

De asemenea se recomanda hidroliza enzimatica pentru separarea si cuantificarea vitaminelor din diferite matrici biologice.

IV. BIBLIOGRAFIE

Banu, C., Biochimia produselor alimentare, 1971, Editura Tehnica, Bucuresti

Bodea,C. si colab., Tratat de biochimie vegetala, 1982, Editura Academiei, Bucuresti;

Neamt, G. si colaboratorii, Biochimie vegetala, 1995, Editura Academica, Bucuresti;

Neamtu, G., Substante naturale biologic active(volumul I),vitamine, 1996, Editura Ceres, Buc.

5. Neamtu G., Cimpeanu,Gh., Socaciu C., Biochimie vegetala(partea structurala), 1993, Ed. Didactica si pedagogica,Buc,

6. Andrei Sanda, Pintea Adela, Vitamine,Enzime ,Hormoni,Analiza biochimica, 2004, Ed. Clusium,Bucuresti

7. Marutoiu, Tofana, Cromatografia pe strat subtire,analiza produselor alimentare, 2005, Ed. Etnograph,Cluj-Napoca

8. Miere Doina, Chimia si igiena alimentelor, Vol I, 2002, Ed. Med. Univ. Iuliu Hategan, Buc.

9. Nedelcu Mariana, Chimia organica, 2002, Ed. Crepuscul,Bucuresti

10. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, VCH, Weinhem, 1996.

11. Amidzic R., J. Brboric, O. Cudina, et al., 2005, RP-HPLC Determination of vitamins B1, B 3, B6, folic acid and B12 in multivitamin tablets, J. Serb. Chem. Soc., 70(10), 1229-1235.

12. Jedlicka A., J. Klimes, 2005, Determination of Water- and Fat-Soluble Vitamins in Different Matrices Using High-Performance Liquid Chromatography, Chem. Pap., , 202-222.

13. Klejdus B., Jitka Petrlova, D. Potesil, et al., 2004, Simultaneous determination of water- and fat- soluble vitamins in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection, Anal. Chim. Acta, 520, 57-67.

14. Nascu Horia Iustin , Lorentz Jäntschi, Chimie analitica si instrumentala, 2006, Ed. Academic Pres & AcademicDirect,Cluj-Napoca.

15. Lorentz Jäntschi, Chimie Fizica. Analize Chimice si Instrumentale, 2004, Editura AcademicDirect, Cluj-Napoca.