 |  |
|
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA
(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC)
Determinarea cafeinei din cafea, ceai si bauturi racoritoare
Scopul lucrarii
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC) este utilizata pentru a determina continutul de cafeina din diverse produse alimentare.
Introducere
In cromatografia de lichide cu faza inversa (RP-HPLC) se foloseste o faza stationara nepolara (de obicei un strat hidrocarbonat legat pe un suport de silicagel) si o faza mobila polara (de obicei un amestec de apa si un solvent mai putin polar). Metoda de detectie cea mai comuna este spectroscopia UV.
In acest experiment se vor prezenta principiile si operatiile de baza ai cromatografiei de inalta performanta.
Folosind solutii standard de cafeina se va determina continutului de cafeina din diverse probe si se va determina si eficienta coloanei cromatografice (numarul talerelor teoretice).
Aparatura
Sistemul cromatografic va fi conectat si pregatit in vederea utilizarii. Schema bloc a unui cromatograf de lichide este redata in figura de mai jos:
Figura 1. Schema generala al unui sistem de cromatografie lichida
Un cromatograf de lichide este echipat cu unul sau mai multe rezervoare de sticla de capacitati diferite.
Faza mobila se filtreaza si se degazeaza inainte de folosire. Filtrarea se face la vid prin trecerea eluentului printr-o membrana de teflon cu porii de 0,2 µm. Degazarea se efectueaza prin ultrasonare timp de 15 minute. Inaintea intrarii eluentului in pompa el este filtrat inca odata de catre filtrul de otel inoxidabil existent la capatul conductei de admisie in pompa.
Sistemul de alimentare cu eluent a coloanei are un rol foarte important in privinta reproductibilitatii parametrilor de retentie si a stabilitatii liniei de baza a detectorului.
Pompa Shimadzu LC-10AS este o pompa cu regim izocratic, prevazut cu doua pistoane, atenuator de pulsatii si un traductor de presiune. Ea este capabila sa furnizeze un flux de faza mobila precis si lipsit de pulsatii.
Valva de injectie de inalta presiune este prevazuta cu o bucla de injectie de 20 µL. Aceasta bucla se umple prin injectarea unui exces de solutie de analizat (minim 2-3 ori volumul declarat al buclei). Aceasta metoda de injectie ofera o introducere precisa a unui volum constant de proba.
Coloana cromatografica este piesa cea mai importanta dintr-un cromatograf, fiind sediul procesului de separare cromatografica. Corpul coloanei este confectionat din otel inoxidabil cu dimensiunile 4,6 mm (diam. intern) x 200 mm (lungime), fiind umplut cu faza stationara chimic legata (particule de silicagel de 5 µm acoperiti cu un strat monomeric de octadecilsilan (C18)).
Coloana cromatografica este inclusa in incinta unui termostat CTO-10A menit sa controloze temperatura (35oC) fazei stationare si mobile pe tot parcursul separarii cromatografice.
Detectorul UV-VIS Shimadzu SPD-10A, capabila de a furniza radiatie luminoasa cu lungime de unda variabila, se seteaza la 272 nm, fiind prevazut cu o lampa de deuteriu (λ=190-380 nm). Pentru lungimi de unda mai mari, lampa de 2D se poate inlocui cu o lampa de tungsten (350-800nm).
Achizitia datelor se declanseaza la
comutarea valvei de injectie din pozitia "LOAD" in pozitia "INJECT".
Datele se colecteaza cu ajutorul unei placi de achizitie
incorporate in modulul de control al sistemului HPLC Shimadzu, ele fiind
transferate, prelucrate si evaluate cu ajutorul programului LC Solution
(Shimadzu). Prin intermediul acestui program este posibila prelucrarea
datelor obtinute, validarea metodei de analiza si generarea de
diferite rapoarte despre parametrii si eficienta separarii.
Procedura de lucru
I. Prepararea solutiilor standard
Se prepara o solutie blanc (martor) si 5 solutii standard cu concentratia cafeinei de 0, 10, 20, 40, 60, 80 mg/L prin masurarea a 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 si 4,0 mL din solutia stoc de cafeina in baloane cotate de 25 mL si se aduc la semn cu faza mobila.
II. Prepararea probelor de analizat
Alegeti cel putin 2 probe necunoscute de cafea, ceai (negru sau verde) sau bautura racoritoare cu continut de cafeina.
Se cantaresc cu exactitate in jur de 0,2000 g cafea sau 0,8000 g ceai, cantarirea efectuandu-se cat mai rapid pentru a evita adsorbtia umiditatii din aer. Probele cantarite se transfera in flacoane conice prevazute cu dop si se adauga 10,0 mL metanol. Se agita puternic si se ultrasoneaza timp de 5 minute pentru extragerea alcaloidului. Se filtreaza o portiune din extractul metanolic obtinut intr-un alt flacon sau eprubeta.
Cafea: Din solutia limpede obtinuta se masoara cu micropipeta 100 μL intr-un balon cotat de 10 mL si se dilueaza pana la semn cu faza mobila.
Ceai negru sau verde: Din solutia limpede obtinuta se masoara cu micropipeta 1 mL intr-un balon cotat de 10 mL si se dilueaza pana la semn cu faza mobila.
Se masoara in jur de 5 mL bautura racoritoare intr-un pahar Berzelius si se ultrasoneaza timp de 5-10 minute pentru o degazare completa a probei. Se masoara 500 μL proba degazata si se dilueaza intr-un balon cotat de 5 mL cu faza mobila.
III. Separarea cromatografica
Se verifica daca pompa si detectorul sunt porniti si ca exista suficienta faza mobila in rezervorul de solventi. Spalati de trei ori microseringa cu faza mobila inaintea inceperii injectiei probelor si intre acestea.
a. Setarea debitului de faza mobila
Debitul se creste gradat la valoarea dorita (0,8 mL/min). Se recomanda initial setarea debitului la 0,2 mL/min. Dupa ce presiunea s-a stabilizat, debitul se creste cu inca 0,2 mL/min. Se continua astfel pana la atingerea unui debit de 0,8 mL/min.
Se noteaza presiunea finala:
P = bar
Se va monitoriza linia de baza si nivelul zgomotului de fond al detectorului.
b. Injectarea standardelor; calibrare
Cu valva de injectie in pozitia "LOAD" (Incarca) se umple bucla de injectie prin injectarea a ~60 μL din solutiile standard de cafeina (10, 20, 40, 60, 80 mg/L cafeina). Solutia in exces este eliminat si volumul injectat va fi determinat de capacitatea buclei de injectie (20 μL)! Microseringa se lasa in valva de injectie. Printr-o miscare fina si rapida se invarte maneta injectorului in pozitia "INJECT" (Injecteaza), colectarea datelor pornindu-se automat.
Cu injectorul ramas in pozitia "INJECT" se poate scoate microseringa pentru o noua reincarcare cu solutie. Dupa reumplerea microseringii, la urmatoarea injectare de proba valva se muta din nou in pozitia "LOAD", se introduce microseringa si se injecteaza ~60 μL solutie, urmand pasii descrisi mai sus.
CELE 5 SOLUTII STANDARD SE INJECTEAZA PE RAND IN DUPLICAT!
Pentru prima solutie standard se calculeaza timpul si volumul de retentie al cafeinei.
tR = min
VR = mL
c. Injectarea probelor
Dupa injecterea a celor 5 solutii standard urmeaza injectarea urmatoarelor solutii in ordinea data mai jos:
Solutia blanc (0 mg/mL cafeina) - IMPORTANT: Blancul se injecteaza pentru testarea liniei de baza!
Solutiile diluate de proba necunoscuta (in duplicat)
Solutie teofilina 50 mg/L
Solutie teobromina 50 mg/L
IV. Rezultate si discutii
Toate rezultatele obtinute se vor copia in caietele de lucrari practice si se vor introduce si intr-un fisier Excel!
Calibrare
prin determinarea ariei si inaltimii picurilor de cafeina se stabileste curba de calibrare, reprezentand aria (respectiv inaltimea) picurilor in functie de concentratia solutiilor standard de cafeina.
Comentati liniaritatea dreptelor obtinute!
Continutul de cafeina al probelor analizate
Prin extrapolarea ariilor (inaltimilor) obtinute pentru solutiile proba se determina concentratia in cafeina a probelor injectate si tinand cont de dilutiile efectuate se calculeaza continutul in cafeina (mg/g sau mg/mL) a probelor initiale.
Comentati rezultatele obtinute!
Folosind cromatogramele obtinute pentru teofilina si teobromina comentati daca careva din picurile aditionale obtinute in cromatogramele probelor necunoscute se pot atribui uneia din aceste substante.
Calculati factorul de capacitate (k') pentru cafeina din solutia standard.
Determinati latimea picului la jumatatea inaltimii pentru cafeina la solutia standard cu concentratia cea mai mare. Calculati apoi numarul de talere teoretice (N) ai coloanei cromatografice.
Acest document nu se poate descarca
| E posibil sa te intereseze alte documente despre: |
| Copyright © 2024 - Toate drepturile rezervate QReferat.com | Folositi documentele afisate ca sursa de inspiratie. Va recomandam sa nu copiati textul, ci sa compuneti propriul document pe baza informatiilor de pe site. { Home } { Contact } { Termeni si conditii } |
Documente similare:
|
Cauta document |