Electroforeza proteinelor pe hartie de filtru

Electroforeza proteinelor pe hartie de filtru

Principiul metodei

O proba de material biologic (ser) care contine proteine este depusa pe o banda de hartie de filtru speciala. Sub influenta curentului electric aplicat la capetele acestei benzi imbibate in solutie tampon cu pH = 8,6, particulele de proteine plasmatice incarcate negativ se deplaseaza spre anod (+) cu viteze de migrare diferite, specifice fiecarei fractiuni proteice, separandu-se. In prezenta unui colorant proteinofil fractiunile separate se evidentiaza sub forma de benzi cu pozitii decalate datorita mobilitatii electroforetice diferite pe care la poseda. Imaginea obtinuta dupa separare si colorare poarta denumirea de electroforegrama. Evaluarea fractiunilor proteice separate se face dupa intensitatea culorii obtinute prin procedeul elutiei sau direct.

Materiale necesare

1. Aparatul de electroforeza

a. Sursa de curent este alcatuita dintr-un  redresor care furnizeaza curent continuu prin stabilizarea curentului de la retea. Redresorul debiteaza o tensiune reglabila intre 0 - 500 volti si o intensitate maxima a curentului de 50 mA. Redresorul este prevazut cu un voltmetru si cu un miliampermetru necesare ajustarii si stabilizarii exacte a parametrilor care definesc campul electric pentru efectuarea electroforezei (120 sau 200 V).

b. Cuva de electroforeza alcatuita din:

cutie de material plastic cu doua compartimente pentru electrozi, ce comunica intre ele, unul pentru anod si celalalt pentru catod, in care se introduce solutia tampon de pH si tarie ionica cunoscute;

electrozi de carbune sau de sarma de platina spiralata, care sunt dispusi in fiecare compartiment;

suport detasabil care permite fixarea in pozitie orizontala a benzilor de hartie de filtru pe care se realizeaza fractionarea proteinelor;

capac care inchide etans cuva de electroforeza si prin care se poate urmari procesul de migrare electroforetica;

2. Suportul de migrare este reprezentat de o hartie de filtru speciala tip Whatman nr.1, 4 sau 100, taiata sub forma de benzi, cu dimensiunile de 3/30 cm. Hartia de filtru trebuie sa prezinte urmatoarele caracteristici:

structura omogena si grosime uniforma pe toata suprafata;

suprafata neteda si curata;

nu adsoarbe proteine;

absorbtie minima si egala pentru toate fractiunile proteice.

3. Reactivii

a. Solutie tampon:

acid dietilbarbituric(barbital) 1,84 g

sarea de sodiu a acidului dietilbartituric (dietilbarbiturat) 10,30 g

Se aduce la un litru cu apa distilata.

Caracteristici:

buna conducatoare de electricitate

pH constant = 8,6 > pHi

pH = 8,6 > pHi la care toate fractiunile proteice sunt incarcate negativ (anioni) si migreaza spre polul pozitiv (pHi = 4,9 pentru albumine, pHi = 6,5 pentru γ-globuline)

b. Solutia de colorare:

albastru de bromfenol 0,01 g

sulfat de zinc 5 g

acid acetic glacial 5 ml

Se aduce cu apa distilata la 100 ml.

Caracteristici:

se fixeaza pe toate proteinele de pe suportul de migrare in cantitati direct proportionale cu cantitatile fractiunilor proteice.

c. Solutia de spalare:

acid acetic 5%

Solutia de spalare indeparteaza colorantul de pe hartia de filtru, astfel incat raman colorate numai fractiunile proteice.

d. Solutia de etalare (eluanta):

carbonat de sodiu cristalizat 10%.

Solutia de carbonat de sodiu se amesteca in volume egale cu metanol (metanolul se adauga in cantitati mici, cu agitarea recipientului, pentru a evita precipitarea).

Solutia eluanta dizolva colorantul fixat pe proteine, care trece de pe fractiunea proteica fixata pe hartia de filtru in solutia eluanta. Aceasta se va colora cu atat mai intens cu cat fractiunea proteica a fost mai colorata (direct proportional cu cantitatea de proteina din fractiunea respectiva).

4. Dispozitiv automat sau fotometru pentru evaluarea cantitativa:

Fractiunile proteice separate se pot evalua cantitativ prin doua procedee:

prin fotometrare directa a electroforegramei, utilizand un densitometru (intregrator) automat si obtinerea curbei respective din care se calculeaza procentul fiecarei fractiuni proteice separate;

prin decuparea spoturilor colorate, elutia lor si determinarea extinctiei la fotometru.

5. Alte materiale necesare:

stativ cu eprubete

micropipete

foarfece

bai de colorare

bai de spalare

vase cu solutie dezinfectanta

apa distilata

tifon

Proba

Ser

Tehnica de lucru:

a. Aplicarea probei

Pe benzile de hartie de filtru speciala, cu dimensiunile mentionate anterior, se marcheaza transversal linia de start, cu creionul, la 8 cm distanta de unul din capetele benzii. Linia de start reprezinta pozitia de aplicare a probei supuse analizei.

Se umecteaza benzile de hartie de filtru in solutia tampon cu pH = 8,6 si se elimina excesul de lichid prin tamponarea lor cu hartie de filtru obisnuita.

Se asaza cuva pentru electroforeza in pozitie orizontala pe o masa.

Se toarna solutie tampon in cele doua compartimente ale electrozilor (acestea comunica intre ele, astfel incat prin inclinarea usoara a cuvei lichidul ajunge la acelasi nivel in ambele compartimente)

Se intind benzile in pozitie perfect orizontala pe suportul amplasat in cuva de electroforeza, astfel incat capetele acestora sa fie imersate in solutia tampon din cele doua compartimente ale cuvei.

Capatul benzilor prevazut cu linia de start se asaza spre catod, deoarece directia de migrare a fractiunilor proteice va fi spre anod (pH-ul tamponului fiind in domeniu alcalin, proteinele se vor incarca electronegativ).

Se lasa benzile sub tensiunea curentulului electric timp de 15 minute, pentru echilibrare.

Se aplica cu ajutorul unei micropipete 10 l din proba de ser. Aplicarea probei se face prin miscari liniare repetate ale varfului pipetei de-a lungul liniei de start (se evita aplicarea probei pana la marginile benzii).

b. Migrarea

Se asigura etanseizarea cuvei de migrare cu ajutorul capacului, se pune in functiune redresorul si se stabilesc parametrii curentului electric (tensiunea si intensitatea).

Tensiunea (diferenta de potential) se calculeaza prin raportare la lungimea benzii de hartie, iar intensitatea curentului prin raportare la latimea benzilor de hartie. In general se recomanda ca tensiunea sa nu depaseasca 10 V/cm, iar intensitatea 2,5 mA/cm.

Dupa terminarea timpului de migrare (migrare rapida 4 - 6 ore sau  migrare lenta 18 ore) se intrerupe curentul si se scoate din cuva suportul cu benzile de hartie.

Benzile de hartie se usuca la temperatura camerei timp de 30 de minute, apoi se introduc in etuva la 110°C timp de 15 minute pentru fixarea proteinelor separate.

c. Colorarea

Benzile de hartie de filtru se imerseaza intr-o baie de colorare care contine solutia de albastru de bromfenol cu care se lasa in contact timp de cel putin 30 de minute.

Dupa acest interval de timp benzile se introduc in baia care contine solutia de spalare si se repeta de cateva ori operatia de spalare, pana ce fondul hartiei devine incolor. Prin indepartarea excesului de colorant neretinut de fractiunile proteice, acestea apar individualizate sub forma de benzi colorate in albastru.

Ulterior, benzile de hartie de filtru pe care sunt etalate fractiunile proteice se usuca la temperatura ambianta, iar dupa uscare se trec prin vapori de amoniac care schimba culoarea indicatorului, fractiunile proteice separate devenind albastru - violet.

d. Evaluarea cantitativa a electroforegramelor:

Electroforegrama obtinuta prin separarea proteinelor serice se compune din cinci fractiuni proteice, sub forma de benzi, carora li se masoara densitatea optica, fiecare banda avand un maxim de absorbtie.

In ordinea mobilitatii electroforetice (exprimata ca diferenta in centimetri de la linia de start pana la mijlocul fiecarei fractiuni separate), fractiunile sunt: albumina, α₁, α₂, β si γ- globuline.

Albumina este fractiunea cu cea mai mare mobilitate electroforetica, fractiunile α si β poseda mobilitate electroforetica intermediara, iar globulinele, mobilitatea cea mai mica. Albumina, α₁ si β globulinele apar sub forma unor benzi omogene, bine definite, α₂ si γ globulinele apar ca benzi difuze, iar fractiunea γ prezinta in partea sa centrala o zona mai intens colorata.

Figura 49  Aspectul benzilor fractiunilor proteice separate

electroforetic insotite de electroforegrama normala

Se pregatesc cinci eprubete in care se pipeteaza cate 5 ml de solutie eluanta.

Se traseaza cu creionul pe electroforegrama conturul fiecarei fractiuni colorate.

Se decupeaza cu foarfeca fiecare fractiune, taind suprafata respectiva de hartie de filtru in portiuni mici.

Portiunile de hartie corespunzatoare fiecarei fractiuni se introduc separat in cele cinci eprubete pentru eluarea colorantului retinut de fractiunea respectiva.

Se astupa eprubetele si se lasa 30 de minute pentru eluarea colorantului, timp in care eprubetele se agita de cateva ori.

Dupa omogenizare se determina la fotometru, la lungimea de unda de 570 nm, in cuve de 1 cm extinctia lichidului colorat obtinut dupa eluare.

Se obtin pentru fiecare banda cinci valori de densitate optica proportionale cu concentratiile proteinelor din zonele respective (albumine, α₁, α₂, β si γ- globuline).

Se calculeaza totalul acestor valori care se considera 100%.

Se calculeaza valorile procentuale ale fiecarei fractiuni proteice separate electroforetic, dupa urmatoarea formula:

x = E

unde:

x = valoarea procentuala a fiecareia dintre cele cinci fractiuni proteice separate

E = extinctia determinata a fractiunii x

= suma extinctiilor celor cinci fractiuni (considerata 100 %)

Pentru a exprima fractiunile in g/100 ml ser, se determina valoarea proteinelor totale si se calculeaza cantitatile corespunzatoare fiecarei fractiuni pe baza concentratiilor procentuale obtinute.

Raportul albumina/globuline (A/G) se calculeaza prin relatia:

A/G = E albumina / Σ E globuline