CARF - o proteina reglatoare a caii p53 de senescenta si supresie tumorala

CARF - o proteina reglatoare a caii p53 de senescenta si supresie tumorala

Articol publicat in: Mechanisms of Ageing and Development 130 (2009) 18-23.

Autori: Caroline T.Y. Cheung, Md. Kamrul Hasan, Nashi Widodo, Sunil C. Kaul, Renu Wadhwa.

Abstract

Senescenta replicativa, finalitate normala pentru celulele cu o lungime finita de viata, este un model in vitro acceptat pe larg pentru studiile ce privesc imbatranirea. Mecanismele limitate de refacere si aparare ale celulelor normale, in plus fata de modificarile ADN si inducerea de oncogene in conditii de stres au ca rezultat senescenta ca mecanism de protectie contra proliferarii nedorite a celulelor. Calea ARF/p53/p21 de supresie tumorala actioneaza ca si senzor molecular si reglator al stresului celular, senescentei si imortalizarii. Intelegerea reglarii moleculare a acestei cai prin semnale intrinseci si extrinseci este extrem de importanta pentru a intelege aspecte inca nerezolvate din imbatranire si cancer. CARF a fost descoperita pentru prima oara ca si partener de legare pentru ARF si de atunci i s-au gasit functii atat ARF dependenta cat si independente, care converg toate spre calea p53. CARF seleaga direct la p53 si HDM2, si functioneaza intr-o cale de reglare prin feed-back negativ. In timp ce CARF represeaza transcriptional HDM2 pentru a creste activitatea lui p53, HDM2 in schimb degradeaza CARF. Astfel, CARF poate actiona ca un nou reglator cheie a caii p53 la multiple punte de legatura. Tinta acestui articol este sa discute cunostintele actuale despre functiile CARF si impactul sau asura caii p53 in reglarea senescentei si carcinogenezei.

Introducere

Senescenta: un rezultat al supresiei tumorale si al mecanismelor de regenerare si aparare ineficiente.

Potentialul de repicare limitat si durata vietii celulelor normale, numit si senescenta replicativa sau limita Hayflick se bazeaza pe numerosi factori, precum apararea si repararea limitata a celulelor normale, care converg in mecanisme active de supresie tumorala. In ultimele decenii, studii genetice si moleculare au revelat numeroase efecte ale senescentei celulare si rolul lor in controlul imortalizarii celulare si tumorigenezei. Oricum, legatura puternica intre imbatranire si cancer a fost scoasa la lumina de un numar de descoperiri cheie care includ:

(i)   disreglarea mecanismelor de supresare tumorala este o caracteristica a ambelor fenomene

(ii) pierderea telomerelor ( o caracteristica bina stabilita a celulelor imbatranite) care poate servi ea insasi ca un mutagen robust si determina fuziuni cromosomale capat la capat si aneuploidie, formand o legatura puternica intre senescenta si aneuploidie;

(iii)       Leziunile cauzate in ADN de radicalii liberi determina celulele fie sa moara fie sa supravietuiasca cu degenerari functionale, care pot duce la cancere;

(iv)       Senescenta e acompaniata de reglarea pozitiva a genelor ce codifica pentru o varietate de factori de crestere solubili, enzime remodelatoare de matrice, si citokine proinflamatorii care contribuie la patologiile legate de varsta care includ cancerele.

S-a demonstrat ca inactivarea unuia sau mai multor mecanisme de suprimare tumorala se petrece deseori in timpul imortalizarii celulare si/sau tumorigenezei, ducand la intelegerea faptului ca senescenta celulara este un mecanism de supresie tumorala. Alte caracteristici ale cancerului implica alterari ale ADN, precum mentinerea lungimii telomerelor si instabilitate genomica. Datorita problemei implicite de terminare a replicarii in celulele eucariote, sfarsitul cromozomilor (telomerele) se scurteaza de fiecare data cand celula se divide. Astfel, lungimea telomerelor ne poate oferi o masura a timpului celular, numindu-se si "pastratorii timpului celular". O sustinere fenomenala privind rolul scurtarii telomerelor in senescenta a fost oferit de studiile ce folosesc celule tumorale aratand o mentinere a telomerelor, cauzata fie de o supraexpresie a telomerazei, sau de mecanisme independente de aceasta, numite alungiri alternative ale telomerelor. Celulele tumorale sunt marcate mereu de anomalii cromosomale si instabilitati variind de la mutatii, deletii, amplificari, translocari si anuploidii. Desi mecanismele moleculare ale instabilitatii genetice in cancer nu sunt bine intelese, dovezi experimentale considerabile sustin implicarea ruperilor bicatenare ale ADN si a unor mecanisme de reparare ineficiente care necesita activarea de multiple gene inclusiv: BRCA1, ATM, ATR, Chk 1, Chk 2, BLM, RAD50, MRE11, NBS1, p53, H2AX si altele. S-a demonstrat ca fosforilarea histonei H2AX faciliteaza formarea de loci de distrugere aADN in jurul telomerelor fara cap, fpt care activeaza kinazele in aval Chk1 si Chk2 si, in final, p53. Activarea persistenta a acestei cai de semnalizare este necesara pentru a mentine celulele intr- stare de senescenta. Astfel, senescenta celulare poate fi privita ca o stare permanenta de alerta la lezarea ADN.

Senescenta este caracterizata de mai multe trasaturi fenotipice: celula se largeste si capata o forma plata si neregulata.; creste expresia de beta galactozidaza; apar alterari in expresia genica, inclusiv pentru p53 pRB, p21 si p16, care par a fi relevante functional pentru stabilirea si mentinerea starii senescente. Ele sunt insotite de o scadere a (i) capacitatii defensive a celulei, inclusiv chaperonele si degradarea proteasomala care recicleaza deseurile moleculare; (ii) activitatilor antioxidante care protejeaza celulele si organitele impotriva moleculelor inalt reactive, cum sunt radicalii liberi, produsi inevitabili ai consumului de oxigen.

Mecanismele mentionate au fost deseori mentionate ca factori care alimenteaza imbatranirea. Celulele tumorale dezvolta frecvent mecanisme pentru a inactiva supresorii tumorali si a depasi capacitatile limitate de aparare ale celulelor normale.

2. Reglarea supresiei tumorale si caile metabolice ale senescentei

2.1. p53 si pRB

Datorita rolului critic al p53 si proteinei retinoblastoma in progresia ciclului celular si frecventa lor inactivare in cancerele umane, ambele gene sunt reglatori cheie ai tumorigenezei. In special, rolul p53 in imbatranire si cancer este nedisputat, desi mecanismele exacte raman inca neelucidate. Modele murine cu nivel crescut al activitatii p53 au aratat rezultate contrastante datorita diferentelor in alelele transgenice p53. In timp ce studiile utilizand animale cu alele p5 mutate sau truncate au demonstrat imbatranire accelerata si durata de viata scurta, soriceii cu multiple copii ale locusului p53 au prezentat o incidenta scazuta de cancer dar fenomene de imbatranire si durata de viata normale. In plus, animalele transgenice avand copii suplimentare de p53 si factorul sau reglator p19^ARF demonstreaza un nivel inalt de rezistenta la tumori si intarziere a imbatranirii. Aceste studii au subliniat importanta reglarii activitatii p53 si nu doar expresia sa.

2.2. Ink4a/locusul ARF

Proteinele locusului INK4a (MTS1, CDKN2) regleaza functional si leaga aceste doua cai metabolice de supresie tumorala si control al ciclului celular. Locusul INK4a, de pe cromosomul uman 9p21, codifica p16 si o alta proteina nelegata p14 (p19 la soarece; de aici inainte, ARF este utilizat pentru a denumi p14), o peptida alternativa care actioneaza in amonte de p53. Alterari ale locusului INK4a sunt caracteristici care ies in evidenta intr-o multitudine de forme de cancer, inclusiv melanom, cancer de san, linfom si carcinom oral. Ambele proteine joaca un rol in imortalizalizarea celulelor umane, ca si in senescnta replicativa prematura si cea indusa de ras in celulele primare. Avansarea in varsta la soricei corespunde reglarii pozitive a proteinelor corespunzatoare INK4a in anumite tesuturi, care la randul lor ar putea limita proliferarea celulelor stem si hematopoietice in vivo. pRB hipofosforilata se leaga de si inactiveaza familia E2F de factori transcriptionali si inhiba progresia ciclului celular. Activitatea complexelor cicline- CDK este inhibata de doua clase de inhibitori, p21 ( un efector in aval de p53) si p16. In timp ce p16 se comporta ca un inhibitor al complexelor cicline - CDK si previne fosforilarea lui pRB, ARF regleaza ambele cai ale lui p53 si pRB. Inducerea expresiei ARF stabilizeaza si creste activitatea p53, ducand la reglarea pozitiva a p21, care la randul ei inhiba CDK si fosforilarea pRB.

ARF este un jucator cheie al supresiei tumorale si inducerea senescentei datorate functiilor sale reglatorii in controalele ciclului celular mediate de p53 si pRB. Expresia ectopica a ARFcauzeaza oprirea cresterii cu urme ale senescentei premature. Un model presupune functionarea ARF prin legarea ubicuitin ligazei MDM2 sau HDM2 la oameni, sechestrarea lui in nucleol, promovarea degradarii lor activand astfel p53 si pRB. Desi co-localizarea ARF-HDM2 in nucleol a fost identificata initial ca si factor cheie in regarea activitatilor pRB si p53, studiile au aratat ca aceasta nu e esentiala pentru functionarea sa si nu se coreleaza complet cu importul HDM2 spre nucleol. Aceste informatii sugereaza ca ARF functioneaza independent de HDM2, implicand posibil alte evenimente legate de homo-oligomerizarea sa. Sau interactia cu diversi parteneri: membrii familiei E2F, spinophilin, topoisomerase I, MDMX, Pex19p/HK33/HsPXF, ciclina G1, helicaza WRN, c-myc, HIF-1a, HIV Tat-binding protein 1, and CARF. Relevanta acestor proteine in senescenta ramane inca de demonstrat. S-a demonstrat in trecut casechestrarea citoplasmica si inactivarea lui p19 se petrece in celulele de soarece dar nu si la om, fapt care explica puternica activare a p53 in celulele umane. Aceasta diferentiere e responsabila de un control ferm al senescentei celulare, briera pentru imortalizare, si o supraveghere mai buna a tumorilor in celulele umane.

ARF si p16 sunt propuse ca bio-markeri pentru imbatranire. Pe cand efectele lui p16 in cancer si senescenta sunt bine definite, dovezile pentru ARF sunt inca neclare. Tesuturile imbatranite de soarece si om arata o crestere a p16, dar dovada pentru prezenta ARF nu e suficienta. In animale restrictionate caloric, un model bine cunoscut de longevitate, atat p19 cat si p16 erau scazute in corelatie cu o rata redusa a nefritelor, hiperplaziei celulelor Leydig, si o scadere a ratei tumorilor. Sharplss a aratat ca animalele deficiente in p16 si/sau p53sunt normale din punct de vedere al dezvoltarii, dar cad prada cancerului mult mai frecvent. Soarecii cu mutatie dubla au durata de viata redusa drastic. In contrast, soarecii super Ink4a/ARF, care poarta un locus suplimentar Ink4a/ARF, in plus fata de genele alele endogene, sunt mai rezistenti la tumorigeneza indusa chimic, si au o incidenta a tumorilor spontane scazuta, fara ca acest lucru sa afecteze durata normala de viata sau imbatranirea.

Proteinele p16 si ARF impart acelasi lous si desi exista dovezi in privinta co-reglarii, in special in celulele rozatoarele, ele apar reglate disparat in celulele umane. Expresia p16 e stimulata de factori de stress precum: lumina UV, activarea oncogenelor, radicalii oxigenului, radiatia ionizanta, agentii chemoterapeutici si disfunctia telomerelor. In contrast, o idee sustinuta este ca in celulele umane, ARF nu este indusa direct de distrugeri ADN ci de activareaoncogenelor. Totusi, oncogenele care induc ARF induc si caile de raspuns fata de leziuni ADN.

ARF poate media raspunsul la leziuni ADN prin efecul pe care il are asupra HDM2 si p53 si, in plus, poate regla reglatorii punctelor de verificare ale ciclului celular care simt lezarea ADN-ului, protein kinazele ATM ( ataxia telangietacsia mutanta) si ATR ( ATM- si Rad3-inrudite). Studii anterioare au aratat ca activarea ATM si ATR indusa de ARF este posibila, ducand la fosforilare a efectorilor lor in ava. In plus, ARF poate forma complexe cu ATR si BRCA1, legarea ducand la relocalizare in nucleol si activarea p53. Prin urmare, ARF ar putea fi activat printr-o interactie fizica directa in absenta altor semnake oncogenice. Este inca neclar daca ARF activeaza semnalizarea ATM si/sau ATR printro interactie directa cu aceste kinaze sau prin alte enzime reglatoare, cum ar fi TIP60, care le poate modifica. Din moment ce gena ARF este dereglata intr-o varietate de boli maligne si se gaseste in cantitati crescute la imbatranire, cautarea de reglatori ai acestei proteine este de cel mai mare interes.

CARF a fost descoperit pentru prima oara ca un nou partener de legare si colaborator al ARF. Studii recente folosind celule umane au aratat ca CARF aremecanisme de reglare a lui p53 dependente si independente de ARF.

2.3. CARF: un jucator cheie in calea metabolica de senescenta a lui p53

CARF ( colaborator al lui ARF) a fost descoperit initial intr-un experiment de explorare folosind un sistem de scanare di-hibrid de levuri cu p19 de soarece ca momeala, si s-au identificat doua proteine ce interactioneaza cu CARF. Pex19p interactioneaza doar cu p19 de soarece si scade functia supresoare tumorala a p53 in celulele de soarece. CARF interactioneaza puternic cu ambele proeteine. Gena CARF umana se gaseste pe cromosomul 4, bratul 4q35 intre markerii D4S415 si D4S408 si pe cromosomul 8, C3-C4 la soarece. Pare a fi o proteina ubicuitara; transcriptul sau a fost gasit in toate tesuturile studiate. CARF uman este o proteina bogata in serina (21%), formata din 580 aminoacizi cu o masa moleculara de 61kDa (Fig.1.). Proteina prevazuta are un situs N de glicozilare, un situs de fosforilare pentru protein kinaza C, un situs de fosforilare pentru tirozin kinaza, un domeniu de legare al ARN dublu catenar si un profil de semnalizare al localizarii nucleare bipartit. Profilul de semnalizare al localizarii nucleare bipartit, 537-551 din CARF, specifica acumularea selectiva in nucleu. Nu are similaritate cu nici o alta proteina din baza de date. Bazandu-ne pe prezicerile programului, CARF are caracteristicile structurale ale unei proteine reglatoare.

Studiile initiale au aratat ca in timp ce ARF se gaseste in principal in nucleol cu o distributie difuza in nucleoplasma si citoplasma, , CARF este localizata in cucleoplasma si pare sa fie exclusa din centrul nucleolului. Aceste doua proteine colocalizeaza la periferie (zona granulara) nucleolului. In plus , CARF da reactie incrucisata cu p14 si p19, sugerand o importanta a conservarii la oameni si soareci. ARF si CARF sunt co-reglate si implicate in stabilizare reciproca.

CARF nu se leaga numai de ARF ci si de p53 in nucleoplasma si o activeaza in mod direct. Supraexpresia CARF in celulele tumorale ( cu sau fara ARF) duce la reglarea pozitia a p53.

Fig. 1. Model ipotetic al structurii CARF.

S-a mai demonstrat si ca proteina CARF functioneaza intr-o bucla de reglare negativa implicand p53 si HDM2. p53 se stie ca sufera degradare de catre HDM2, care regleaza in mod negativ proteinele ( inclusiv pe sine insasi), prin ubicuitinizare si degradare proteosomala. Desi CARF si 53 sunt ubicuitinizate si sunt tinte degradative pentru HDM2, am descoperit recent ca pentru a se proteja de la degradare, CARF actioneaza ca represor transcriptional al HDM2, anuland efectul antagonist pe care il are asupra p53 si activand calea ARF-p53-HDM2-p21. Nivelul de expresie al lui CARF depinde de tipul celular, si in special de starea lui p53. Celulele cu p53 tip wild type exprima CARF mult mai putin decat cele mutante pentru p53. Datele sugereaza ca CARF functioneaza ca si reglator cheie al p53 ca stabilizator si activator pe de o parte, si supresor si antagonist pe de alta parte. In celulele deficiente in ARF, organismele fara expresie CARF nu au suferit modificari ale expresiei p53, desi celulele cu CARF inhibat au nivel crescut de HDM2 si scazut de proteine din aval fata de p53: BAX, PUMA si p21. Prin urmare, CARF nu regleaza pozitiv proteina p53 la nivel transcriptional; in schimb, poate functiona prin stabilizarea si cresterea activitatii lui p53, iar in absenta ARF, nivele reduse de expresie CARF pot fi suficiente pentru stabilitatea p53. [aici am sarit o bucata, nu mai pot] De retinut, in timp ce supraexprimarea CARF in celulele tumorale cu funtie p53 wild type duce la o reducere semnificativa a numarului de colonii, celuelele cu funstie p53 deficienta arata de asemenea reducerea numarului de colonii, sugerand ca desi functia CARF este activarea p53, ea poate functiona si in cai metabolice alternative ce duc la oprirea cresterii celulare.

Perspective viitoare

Exista multe intrebari la care nu se cunoaste inca raspunsul legat de rolul CARF ca si de reglarea in vivo si relevanta caii ARF-p53-HDM2-p21.

Fig.2. Trei cai principale de proliferare celulara.

In prezent, nu s-a facut o caracterizare sistematica si evaluare a exprimarii CARF sau ARF la nivel tisular la indivizi in varsta si tineri pentru investigarea contributiei acestei proteine la senescenta si imbatranire. In plus, rolul CARF in celule stresate si nestresate si impotranta interactiilor ARF dependente si independenta trebuie inca studiata. Din moment ce ARF regleaza si ATM si ATR, e posibil sa fie implicat si in raspunsul la lezarea ADN. Inca nu s-a investigat legarea CARF la ARF-BP1. Mecanismele represiei transcriptionale indusa pentru HDM2 de CARF si a altor proteine potentiale necesita maimulte investigatii. Fig. 2 arata un model al interactiilor si al functiilor cunoscute si ipotetice al CARF.

In ciuda intrebarilor care raman pentru situatia in vivo, infomatiile pe care le avem pana in prezent garanteaza pe deplin entuziasmul in privinta rolului potential al acestei proteine in cancer si imbatranire. Asteptam cu nerabdare urmatoarele analize privitoare la CARF.