AMINOACIZI NATURALI

Prin hidroliza proteinelor, in conditii bine controlate, au fost obtinuti 20 de aminoacizi diferiti, numiti aminoacizi naturali.

In natura exista peste 150 de aminoacizi, dar proteinele sunt formate din numai 20 a-aminoacizi (care fac parte din seria L).

Primul aminoacid izolat dintr-un hidrolizat proteic a fost glicina (glicocolul) (1820):

H₃N⁺-CH₂-COO^-

Aminoacizii din proteine au urmatoarea formula generala:

unde R este catena laterala.

1

.1.1 Clasificarea aminoacizilor

In functie de structura chimica, aminoacizii se impart in sase grupe:

a) Aminoacizi monocarboxilici

glicina alanina valina

Gly, G Ala, A Val, V*

leucina izoleucina fenilalanina

Leu, L* Ile,I^* Phe, F^*

b) Aminoacizi dicarboxilici

acidul asparagic sau aspartic acidul glutamic

Asp, D Glu, E

asparagina glutamina

Asn, N Gln, Q

c) Hidroxiaminoacizi

serina treonina tirozina

Ser, S Tre, T* Tyr, Y^*

d) Tioaminoacizi

cisteina metionina

Cys, C* Met, M*

e) Diaminoacizi

lizina arginina

Lys, K* Arg, R

f) Aminoacizi heterociclici

prolinahistidina triptofanul

Pro,P His, H* Trp, W*

In celula vie prin modificari translationale, prolina si cisteina se transforma in cistina si 4-hidroxiprolina:

cistina 4-hidroxiprolina

Cys - S - S - CysHypro

Aminoacizii naturali care nu pot fi sintetizati de organismul viu sunt notati cu asterisc "*" si se numesc esentiali. Ei trebuie introdusi in organism prin alimentatie.

In afara de aminoacizii prezentati mai sus, in proteine mai exista si alti aminoacizi: 5-hidroxi-lizina din colagen, desmozina din elastina,etc.

In materia vie exista aminoacizi care nu sunt prezenti in proteine: homoserina, homocisteina, ornitina, citrulina; D-alanina si acidul D-glutamic (in peretii celulari bacterieni), acidul g-aminobutiric (neuro-transmitator), tiroxina (hormon tiroidian), etc.

De asemenea, sunt cunoscuti aminoacizi cu actiune toxica pentru formele de viata: acidul djencolic si b-cianoalanina:

acidul djencolic b-cianoalanina

1.1.2 Proprietatile aminoacizilor naturali

3.1.2.1 Stereochimia aminoacizilor naturali

Aminoacizii din proteine sunt a- aminoacizi si fac parte din seria L.

In afara de prolina si glicocol, ei au formula generala:

Pentru determinarea stereochimiei unui aminoacid, termenul de referinta este L-serina, care are configuratia S, conform configuratiei absolute CIP (Cahn-Ingold-Prelog), asemanatoare cu configuratia L-glicerinaldehidei, termenul de referinta pentru monozaharide:

In seria aminoacizilor incadrarea in seria D sau L se face considerand configuratia atomului de carbon vecin grupei mai oxidate (carboxilul), in timp ce in seria monozaharidelor se considera configuratia atomului de carbon cel mai departat de gruparea oxidata (carbonil).

In cazul unui aminoacid cu doi atomi de carbon chirali, exista doi racemici, deci patru stereoizomeri optici.

Exemplu: treonina: L- si D- treonina (forma treo),

L- si D-alotreonina (forma eritro):

Determinarea configuratiei aminoacizilor s-a facut prin reactii chimice urmarindu-se inrudirea cu un compus sau aminoacid cu structura cunoscuta. In Figura 3.1 se observa relatia intre L-serina si L-alanina, L-cisteina si

L-asparagina:

Figura 3.1: Influenta reactiilor chimice asupra activitatii optice

Ca si in cazul monozaharidelor, nu toti aminoacizii din seria L deplaseaza planul

luminii polarizate spre stanga (nu sunt levogiri).

Astfel urmatorii aminoacizi: alanina, valina, izoleucina, acidul glutamic, glutamina, arginina, lizina, izolati din proteine, sunt dextrogiri.

3.1.2.2 Starea de agregare

Aminoacizii sunt compusi solizi, amfionici, cu puncte de topire foarte ridicate (peste 200^oC).

3.1.2.3 Spectre de absorbtie

Aminoacizii aromatici (tirozina, triptofanul, fenilalanina) absorb in ultraviolet la l = 280 nm.

Aceasta proprietate permite dozarea continutului proteic al unei solutii.

3.1.2.4 Solubilitate

Aminoacizii sunt compusi solubili in apa si in solventi polari.

Tirozina, fenilalanina si triptofanul sunt solubili in solutie alcalina.

Proprietatile aminoacizilor naturali sunt determinate de structura catenelor laterale R.

In functie de comportarea fata de apa, aminoacizii sunt:

- hidrofobi (nepolari) - cu catene R hidrofobe: alanina, valina, leucina, izoleucina, metionina, triptofanul, fenilalanina, prolina, cisteina, glicina;

- hidrofili (polari)

- cu catene R neutre : asparagina, glutamina, serina, treonina, tirozina;

- cu catene R bazice ( incarcate pozitiv la pH = 7) lizina, arginina, histidina;

- cu catene R acide ( incarcate negativ la pH = 7) acidul aspartic (asparagic), acidul glutamic.

In solutii apoase neutre, aminoacizii prezinta momente de dipol mari datorita existentei amfionului:

NH₃ - CHR- COO ^-

In solutie puternic acida, aminoacizii se gasesc sub forma de cation:

NH₃ - CHR - COOH

In solutie puternic bazica se afla sub forma de anion:

NH₂ - CHR - COO^-

3.1.2.5 Punctul izoelectric

Exista o valoare a pH-ului, numita punct izoelectric, (pI), la care concentratia formei cationice este egala cu cea a formei anionice, forma amfionica fiind predominanta.

La punctul izoelectric solubilitatea aminoacidului este minima, iar migrarea ionilor in cursul electrolizei unei solutii apoase de aminoacid inceteaza.

Cationul unui aminoacid, conform teoriei Brönsted, este un acid bibazic si prezinta doua trepte de ionizare:

Expresiile pentru cele doua constante de aciditate se pot scrie, conform legii maselor, considerand solutia suficient de diluata pentru a inlocui activitatile cu concentratiile speciilor ionice. Variatia concentratiei apei este neglijata:

[⁺NH₃ CHR COO^- ] [H₃O⁺] [NH₂ CHR COO^- ] [H₃O⁺]

K_a1 = -------- ----- ------ -- ;       K_a2 = -------- ----- ------

[⁺NH₃ CHR COOH] [⁺NH₃ CHR COO^- ]

Prin logaritmare si inlocuind: - log[H₃O⁺] = pH, - log K_a1= pK_a1,

-log K_a2 = pK_a2 , se obtine :

[⁺NH₃ CHR COO^- ]

pK_a1 = pH - log ----- ----- --------- ----- ----

[⁺NH₃ CHR COOH]

[NH₂ CHR COO^- ]

pK_a2 = pH - log ----- ----- ---------------

[⁺NH₃ CHR COO^- ]

Daca se titreaza o solutie acida a unui aminoacid cu hidroxid de sodiu pana la semineutralizare (primul punct de echivalenta, pH = pK_a1) cand jumatate din forma cationica a fost transformata in cea amfionica:

[⁺NH₃CHRCOOH] = [⁺NH₃CHRCOO^- ]

Cu exces de baza restul formei cationice este transformat in forma amfionica (pI), apoi se atinge al doilea punct de echivalenta, cand jumatate din forma amfionica este transformata in forma anionica ( pH = pK_a2) si prin continuarea titrarii restul formei amfionice este transformata total in forma anionica.

Expresia punctului izoelectric pentru aminoacizii monocarboxilici si monabazici se poate determina din expresiile pK_a-urilor:

[⁺NH₃ CHR COO^- ] [H₃O⁺]

[⁺NH₃ CHR COOH] = -------- ----- ------ --

K_a1

[⁺NH₃ - CHR- COO^- ] K_a2

[NH₂ CHR COO^- ] = ----- ----- --------- ----- -------

[H₃O⁺]

Se egaleaza cele doua expresii (conditia punctului izoelectric) si se obtine:

[H₃O⁺]² = K_a1 K_a2 de unde rezulta [H₃O⁺] = (K_a1 K_a2)^1/2

Dupa logaritmare si inmultire cu (-1) se obtine:

pI = 1/2 ( pK_a1 + pK_a2)

In Tabelul 3.1 sunt prezentate valori pK_a si pI pentru cativa aminoacizi naturali:

Tabelul 3.1: Valori pK_a si pI ale unor aminoacizi

Valorile din tabelul de mai sus permit calculul raportului

[acceptor de protoni] / [donor de protoni] din legea Henderson- Hasselbalch.

Analizand Tabelul 3.1 se constata ca:

- grupa a-COOH este un acid mai puternic decat acizii alifatici corespunzatori (acidul acetic are pK_a = 4,6); acest fapt se datoreste prezentei grupei amino protonate din pozitia a

- grupa a-⁺NH₃ este un acid tare (baza slaba) in raport cu grupele amino din aminele alifatice corespunzatoare;

- aminoacizii naturali nu au capacitate de tamponare in jurul pH-ului fiziologic (pH = 7) cu exceptia histidinei;

- grupele SH si OH sunt foarte slab acide;

- grupa amino din pozitia e din lizina este baza puternic.

O metoda de dozare a aminoacizilor des utilizata este titrarea cu solutie de NaOH a unei solutii de aminoacid in care s-a adaugat formol 40% (solutie de formaldehida in apa).

Formaldehida in exces se combina usor cu grupele amino libere din aminoacid, iar protonii eliberati se titreaza cu solutie de NaOH pana la

pH = 8 (viraj fenolftaleina):

NH₃ CHR COO^- + 2 CH₂O + H₂O (HOCH₂)₂NCHRCOO^- + H₃O⁺

Aminele tertiare formate sunt baze mai slabe decat cele primare, au pK mai jos si aminoacizii pot fi neutralizati cu baza la pH mai scazut (pH = 8) fata de cazul cand nu se introduce formaldehida (pH = 11-12).

Reactia de recunoastere a aminoacizilor

Aminoacizii reactioneaza cu ninhidrina ( hidrat de tricetohidrindan) cu formarea unui compus colorat albastru-violet, cu exceptia prolinei si hidroxi-prolinei, care formeaza un compus galben.

O schema de mecanism pentru aceasta reactie este prezentata in Figura 3.4 (pag.39).

3.1.2.7 Reactia de dozare a aminoacizilor

Aminoacizii reactioneaza cu acid azotos si pun in libertate azot molecular, care se masoara volumetric, putandu-se determina cantitatea de aminoacid care a reactionat.

Cu aceasta metoda se dozeaza grupele amino libere din peptide sau proteine (metoda van Slyke):

3.1.2.8 Reactiile biochimice ale aminoacizilor

Transformarile biochimice ale aminoacizilor vor fi detaliate in partea a doua a cursului (Catabolismul aminoacizilor):

a)Decarboxilarea

Prin decarboxilare aminoacizii formeaza amine biogene caracterizate prin actiune biologica foarte importanta:

Exemplu: - histamina, se formeaza prin decarboxilarea histidinei (stimuleaza secretia gastrica, este vasodilatator si regleaza tonusul muscular) si este implicata in reactiile alergice ale organismului.

- putresceina si cadaverina, formate prin decarboxilarea ornitinei si lizinei, sunt toxice.

purpura lui Ruhemann

Figura 3.4: Mecanism propus pentru reactia de recunoastere a

aminoacizilor cu ninhidrina

b) Transaminarea

Transaminarea este reactia de transfer a grupei amino de la un aminoacid la un a-cetoacid in prezenta unei aminotransferaze conform urmatoarei ecuatii globale:

a-aminoacid₁ + a-cetoacid₂ a-cetoacid₁ + a-aminoacid₂

Prin transaminare se biosintetizeaza aminoacizi specifici fiecarei celule vii in concentratia necesara si la momentul adecvat.

c) Dezaminarea oxidativa aminoacizilor conduce la a-cetoacizi si

amoniac. Exista aminoacidoxidaze specifice atat pentru L- aminoacizi, cat si pentru D-aminoacizi:

unde FMN este flavinmononucleotida (vezi Vitamine si coenzime, Partea a II-a).

3.1.2.9 Analiza amestecurilor de aminoacizi

Hidrolizatele proteice acide contin aminoacizii componenti si se obtin prin incalzirea unei solutii apoase de proteina (intr-o fiola de sticla inchisa) la 105^oC, in prezenta de HCl 6N, timp de 24 ore.

Desi prin hidroliza acida se distruge triptofanul, iar glutamina si arginina sunt hidrolizate la acizii corespunzatori, in practica se prefera acest tip de hidroliza deoarece reactia in mediu bazic sau enzimatic prezinta mai multe inconveniente.

Amestecul de aminoacizi astfel obtinut se poate analiza cu metode cromatografice:

a)     Cromatografia bidimensionala pe hartie

Pe o hartie de filtru se depune intr-un colt amestecul de aminoacizi

obtinut la hidroliza. Se developeaza cu un solvent organic saturat cu apa realizand o cromatograma monodimensionala, unde se observa o separare a aminoacizilor componenti. Dupa uscarea hartiei se developeaza, in directie

perpendiculara fata de prima, intr-un alt solvent. Astfel se obtine cromato-grama bidimensionala:

Prin pulverizare cu o solutie de ninhidrina se pune in evidenta locul fiecarui aminoacid (pata albastru-violet).

Prin masurarea spectrofotometrica a acestor pete se poate face determinarea cantitativa a aminoacizilor componenti. Pentru o asemenea determinare sunt suficiente 0.2 - 0.4 g de proteina.

Un amestec de aminoacizi obtinut prin hidroliza lanii a fost separat prin aceasta metoda utilizand ca solventi colidina si apoi fenolul.

S-au construit aparate automate de separare cromatografica a aminoacizilor, iar dozarea acestora se face spectrofotometric.

b)     Cromatografia prin schimb de ioni

Aceasta metoda se bazeaza pe deosebirile proprietatilor acido-bazice ale aminoacizilor si se pot separa amestecurile de aminoacizi in trei grupe:

* aminoacizi acizi, retinuti pe rasini schimbatoare de anioni, care sunt

de obicei compusi poliaminati:

Rasina-NH₃⁺OH^- + RCOO^- Rasina NH₃⁺ RCOO^-

* aminoacizi bazici, retinuti pe rasini schimbatoare de cationi (rasini polisulfonate sau policarboxilice):

Rasina-SO₃^- Na⁺ + RNH₃⁺ Rasina-SO₃^- RNH₃⁺

* aminoacizi neutri, nu sunt retinuti de rasini schimbatoare de ioni.

Astfel s-a reusit fractionarea completa a amestecurilor de aminoacizi cu ajutorul polistirenului sulfonat la un pH scazut, unde toti aminoacizii sunt sub forma de cationi, puternic retinuti in partea superioara a coloanei.

Eluarea cu modificarea progresiva a pH-ului conduce la izolarea aminoacizilor componenti care se desorb de pe coloana in functie de capacitatea de ionizare.

c)     Cromatografia in strat subtire

Este o metoda de separare prin cromatografia de lichide, asemanatoare cu cromatografia pe hartie. In locul hartiei se folosesc placi de sticla ( staniu sau material plastic) pe care este depus un strat uniform de faza stationara: silicagel, alumina, etc.

Se depune un spot din solutia de aminoacizi care urmeaza a fi separata si se developeaza cu un amestec de eluare adecvat.

Aminoacizii vor migra mai repede sau mai incet in functie de proprietatile acido-bazice care determina fixarea si retinerea pe faza stationara.

d)     Cromatografia in faza gazoasa

Este o metoda de separare completa a aminoacizilor dupa ce au fost efectuate modificari structurale care sa-i faca volatili:

- metilarea functiilor amino, fenolice sau alcoolice;

- esterificarea grupelor carboxil.

Separarea se face cu ajutorul unor coloane capilare ( cu diametrul 0.1 mm si peste 2 metri lungime), la temperaturi intre 100 - 200^o C, utilizand faze stationare lichide.

Aminoacizii se repartizeaza intre o faza stationara lichida si o faza mobila gazoasa cu viteze diferite, care depind de polaritatea lor.

Prin aceasta metoda se pot separa cantitati foarte mici de aminoacizi (de ordinul picomolilor , 10^-12 moli).

e) Cromatografia de adsorbtie

Aceasta metoda se bazeaza pe principiul adsorbtiei de tip lichid-solid (cromatografie de lichide sub presiune) de inalta rezolutie si de inalta performanta (HPLC).

f) Cromatografia de repartitie in contracurent

Aceasta metoda cromatografica utilizeaza ca faza stationara amidon sau silicagel hidratat, iar faza mobila este un lichid nemiscibil cu solventii in care se afla amestecul de aminoacizi care urmeaza a fi separat.

Cu acest procedeu s-au separat 99% din aminoacizii rezultati la hidroliza albuminei din serul de bovine si din lactoglobulina.