PROCEDURA PRIVIND EFECTUAREA HEMOLEUCOGRAMEI, VSH si a TESTELOR DE COAGULARE

ECHIPAMENTE NECESARE

Prelevarea produsului patologic : prelevarea sangelui pentru determinarile hematologice se face dimineata pe nemancate. Se folosesc vacutainere sau seringi de unica folosinta. Se preleveaza un volum de sange variabil in functie de tipul de analiza, de preferinta din vena de la plica cotului, in felul urmator : pacientul asezat de preferinta pe un scaun de recolta cu o musama sub cot pentru a preveni patarea lenjeriei cu solutii decontaminante sau sange, se fixeaza garoul la 10 cm proximal de zona punctiei, se strange si se relaxeaza de cateva ori pumnul fara a masa bratul. Se descopera vena de la plica cotului, se antiseptizeaza regiunea cu alcool sanitar si se face punctia fie aplicand un vacutainer fie cu o seringa. Dupa recoltare zona punctionata se acopera cu un plasture.

Probele de biochimie si imunologie se recolteaza inaintea celor de hematologie

Prelevarea singelui pentru hemograma se face in vacuette  cu dop mov ce contin anticoagulant EDTA K₃ .

Prelevarea singelui pentru VSH se face in vacuette cu dop negru ce contin anticoagulant citrat trisodic 3,2%,.

Pentru testele de coagulare (timpul de protrombina, si timpul partial de protrombina, fibrinogen) se recolteaza in vacuette cu dop bleu ce contine citrat de sodiu 3,2%.

Dupa recoltare, vacuetele se manevreaza cu delicatete, pentru a preveni hemoliza

Hemoleucograma completa

Se recolteaza sange integral, prin punctie venoasa, in vacuum cu EDTA (cu dop mov). Imediat dupa recoltare se agita usor flaconul prin rasturnare de cateva ori pentru a se amesteca singele cu anticoagulantul si a se evita formarea de microcheaguri.

Inainte de efectuarea hemogramelor, analizorul se deschide si i se da comanda START-UP, rezultatul acestuia trebuie sa fie cu 0 la toti parametrii, moment in care afisaza START-UP PASSED. Daca nu se obtine acest rezultat, se reia procedura de START - UP.

Se introduce sangele de control - minim 2 nivele si se verifica rezultatele obtinute

Se numeroteaza probele

Se lucreaza in ordine toate probele

Se comanda un ciclu de spalare

Dupa aproximativ 100 de probe se efectueaza o spalare concentrata.

Controlul de calitate in faza analitica

Se urmaresc parametrii hematologici determinati prin analiza automata:

WBC - numar de leucocite

RBC - numar de eritrocite

HGB - concentratia de hemoglobina

HTC - hematocritul

PLT - numarul de trombocite

PTC - plateletocritul

indicii eritrocitari: MCV, MCH. MCHC, RDW

indicii trombocitari: MPV ( volumul mediu trombocitar) si PDV (deviatia standard a acestuia)

numaratoarea diferentiala ( formula leucocitara procentuala )

valorile absolute . 10³ / ml

Diferentierea automata a leucocitelor trebuie verificata prin evaluare manuala ( microscopica) a frotiului de sange

PT, IP, INR

PT( timpul de protrombina)

PT este folosit ca test de screening pentru calea extrinseca a coagularii.

Exploreaza factorii coagularii din calea extrinseca ( VII, X, V, II ), care constituie complexul protrombinic.

Principiul testului este recalcifierea plasmei citratate in prezenta unui exces de tromboplastina tisulara ( F III). Coagularea indusa merge pe calea extrinseca, scurtcircuitand factorii din sistemul intrinsec , care activeaza F X.

PT este utilizat in dg: ( este alungit):

deficitului congenital sau dobandit al factorilor: II, V, VII, X

tratament cu antagonosti ai vit. K

diateze hemoragice la nou-nascut

verificarea capacitatii de sinteza a ficatului ( insuficienta hepatica: ciroza, hepatita,icter)

hiperfibrinoliza

CID

PT este indicat in mod special in inducerea si monitorizarea terapiei anticoagulante orale datorita sensibilitatii la factorii dependenti de vit.K : II, VII si X.

IP ( PR) - Indicele de protrombina ( prothrombin ratio)

PT al probei ( sec)

IP ( PR) = -------- ----- ------ ---- . 100 (%)

PT al plasmei normale ( sec)

PT al plasmei normale este valoare unei plasme umane standard sau obtinuta dintr-un pool de 10-20 probe de plasma proaspata ( normala)

Stabilirea curbei de calibrare

Se pot folosi :     - plasme de calibrare

plasma standard umana

plasma proaspata ( pool de 10 - 20 probe)

PT gasiti pot fi introdusi intr-un grafic fata de procentele respective

Curba ideala de referinta este dreapta , dar la dilutii mari ale plasmei timpii sunt mai alungiti si % mai mici. Deci linia dreapta de calibrare poate fi extinsa p.l. 10%.

Sistemul inr

In faza stabila a tratamentului anticoagulant valorile PT pot diferi semnificativ in functie de originea reactivului ( tromboplastinei) si a coagulometrului utilizat.

Pentru rezolvarea acestei probleme, OMS a introdus o procedura de standardizare a rezultatelor, obtinand o valoare ( un indice) independent de reactiv sau de aparat: INR

INR = International Normalised Ratio

ISI = International Sensitivity Index

ISI pentru o anumita tromboplastina se determina facand masuratori comparative intre reactivul de standardizat si o tromboplastina de referinta internationala.

IP poate fi transformat in INR: INR = IP ^ISI

ISI este indicat pntru fiecare lot de reactivi

Utilitatea INR este limitata la pacientii stabilizati sub terapia anticoagulanta orala -3 saptamani de tratament, cu un nivel stabil al anticoagularii)

Se recomanda ca in.:

profilaxia si tratam. trombozelor venoase si a embolismului pulmonar: INR =2-3

( IP = 30 - 40 )

proteze valvulare mecanice, TE recurent, tromboza arteriala : INR = 3-4.5

( IP =20-30)

INR nu are valoare in alte cazuri, cum ar fi: pacienti cu hepatopatii, in timpul trecerii de la tratamentul cu heparina la anticoagulante orale, la bolnavii care primesc tratament anticoagulant, dar nu sunt inca stabilizati (???????)

DETERMINAREA P.T., I.P., I.N.R.

PRINCIPIU: declansarea coagularii plasmei cu tromboplastina si Ca

PROBELE

Plasma se obtine recoltand:  - pe 1parte sol citrat ( O:11 Mol / l )

- 9 parti sg venos

evitand sa se formeze spuma la recoltare.

Practic se recolteaza sange prin punctie venoasa, pe Vacuette cu dop albastru ( cu citrat ) ( 4.5 ml sg la 0.5 ml citrat).

Se centrifugheaza imediat la 3000 t/ min, cel putin 10 min.

METODA:

A)   Clasica ( manuala)

se introduce tubul in baia de apa sau compartimentul de termostatare la 37 ⁰ C

se pipeteaza 100 ml plasma citratata

se incubeaza 1 min la 37 ⁰ C

se adauga 200 ml tromboplastina calcica si simultan se porneste cronometrul

se verifica aparitia cheagului la 10 sec, apoi din sec in sec.

se opreste cronometrul la aparitia cheagului, aceasta fiind PT

In functie de curba de calibrare, si martorul de protrombina se stabileste IP.

B)    AUTOMATA

se pune reactiv ( tromboplastina) in tub, la incubare 37 ⁰ C

se pun in cuvitele mici, in compartimentul de incubare, cate 25ml plasma citratata, cu varfuri separate

se porneste timerul pt 60 sec; se opreste

se apasa tasta active

se muta in compartimentul de citire proba nr. 1

se incarca 50ml tromboplastina

se pipeteaza peste proba simultan cu apasarea inca o data a tastei active

Coagulometrul determina si afiseaza PT, IP, INR.

N.B. La shimbarea lotului de reactivi, se verifica si se introduce in programul aparatului ISI indicat pe cutie.

APTT - Activated Partial Tromboplastin Time

PATHROMTIN SL - DADE BEHRING GmbH - germania

stago Diagnostica - ROCHE

APTT este timpul de  recalcifiere al plasmei sarace in trombocite, in prezenta unei cantitati standard de substitut plachetar ( cefalina, care inlocuieste fosfolipide trombocitare) si a unui activator specific, caolinul.

APTT exporeaza calea intrinseca a coagularii ( este un test de coagulabilitate globala intrinseca):implica factorii plasmatici XII, XI, IX, VIII, X,V, II, I.

Nu implica, deci nu e sensibil la variatiile cantitative sau calitative ale trombocitelor, factorilor VII si XIII

Acest procedeu reduce la maxim variabilele testului, prin standardizarea activarii de contact si optimizeaza concentratia fosfolipidelor platelet-like.

APTT permite un screening rapid al tulburarilor caii extrinsece a coagularii si este foarte sensibil la factorii VIII, IX si factorii de contact.

Este utilizat in : - diagnosticarea hemofiliilor

- monitorizarea terapiei cu heparina

Folosirea APTT ca test de screening al tulburarilor de coagulare este indicata in special inaintea interventiilor chirurgicale, permitand diagnosticarea unei eventuale hemofilii.

Prezenta inor inhibitori nespecifici ai fosfolipidelor folosite in testele de coagulare, cum ar fi anticoagulantii din lupus ( LE) poate prelungi APTT. In aceste cazuri se foloseste reactivul PTT-LA stago Diagnostica - ROCHE

RECOLTAREA PROBELOR

Plasma se obtine recoltand: - pe 1parte sol. citrat trisodic (3.2% sau O Mol / l )  

- 9 parti sg venos

evitand sa se formeze spuma la recoltare.

Practic se recolteaza sange prin punctie venoasa, pe Vacuette cu dop albastru ( cu citrat ) ( 4.5 ml sg la 0.5 ml citrat).

Se centrifugheaza imediat 10 - 15 min. la 3000 t/ min ( 1500x g).

Daca se monitorizeaza terapia cu heparina, trebuie avuta o grija deosebita la recoltare si centrifugare, pentru indepartarea trombocitelor, prevenind inactivarea heparinei.

Plasma supernatanta se pipeteaza in tuburi curate si se pastreaza la temperatura camerei ( 15 - 25 ^o C ) maxim 4 h, sau maxim 2 h daca pacientul este subterapie cu anticoagulante.

MODUL DE LUCRU

METODA MANUALA

N.B. PIPETAREA FIECARUI REACTIV SE FACE CU VARFURI SEPARATE

- se introduce tubul in baia de apa sau compartimentul de termostatare la 37 ⁰ C

se pipeteaza : - plasma citratata . . . ..100 ml

- reactiv PTT . . . . . 100 ml

se incubeaza 2 min la 37 ⁰ C

se adauga CaCl₂ (preincalzit la 37⁰ C) . . . 100 ml

odata cu adaugarea CaCl₂ , se porneste cronometrul, urmarind la 20 sec, apoi din 5 in 5 sec.

Cronometrul se opreste la aparitia cheagului

METODA AUTOMATA (stago Diagnostica - ROCHE)

N.B. PIPETAREA FIECARUI REACTIV SE FACE CU VARFURI SEPARATE

Plasma . . . . . . ..50ml

Reactiv PTT . . . . ..50ml

Incubare 180 sec. ( se porneste timerul de incubare)

Se introduce in compartimentul de citire si se adauga

CaCl₂ ( o.o25M) . . . 50ml

Aparatul sesizeaza aparitia cheagului si afiseaza timpul

Valori normale 24.5 - 35 sec (26 - 36 sec ) functie de reactiv

Scurtarea APTT nu pare a avea o semnificatie patologica, desi unii autori o considera un indiciu de hipercoagulabilitate

Alungirea APTT este considerata patologica atunci cand depaseste cu 10 sec. limita superioara a normalului.

cu timp Quick normal - In deficitele congenitale de F XII, FIX ( hemofilia B), FVIII ( hemofilia A), asociat cu F v.W. scazut ( B. V. Wilebrand)

cu timp Quick alungit: afectiuni hepatice, CID

tratamente cu heparina - valori x 1.5 fata de plasma normala de control

TIMPUL HOWELL (T.H.)

T.H. masoara timpul de coagulare al unei plasme citratate bogata in trombocite, dupa adaugarea de CaCl₂ . Este un test de coagulabilitate globala a caii intrinsece, care implica toti factorii plasmatici, cu exceptia F VII, si factorii plachetari si estimeaza si functia plasmatica si functia plachetara.

Tehnica

Sangele venos recoltat pe anticoagulant se centrifugheaza la 1000 tpm 10 min. Se pipeateaza plasma

Se lucreaza in tuburi curate, uscate, introduse in baia de apa, la 37⁰ C.

Tot in baia de apa se introduce un tub cu solutie de CaCl₂ 0,025 M

se pipeaza 200 ml plasma bogata in trombocite

se incubeaza 2 minute

se aduga 200ml solutie CaCl₂ , pornindu-se simultan cronometrul

se face prima citire dupa 60sec, apoi din 10 in 10 sec, pana la 120 sec, si apoi din 5 in 5 sec.

Se urmareste aparitia cheagului prin inclinarea usoara a eprubetei.

Valori normale: 60 - 120 sec.

Se considera semnificativa o alungire cu mai mult de 20 sec.

Interpretare: alungirea Th deceleaza o hipocoagulabilitate globala. Coroborarea cu rezultatele APTT indica natura plasmatica sau plachetara:

T.H. alungit si A.P.T.T. normal - deficienta este plachetara

T.H. alungit si A.P.T.T. alungit - deficienta este plasmatica

T.H. este testul de electie in urmarirea heparinoterapiei, cand trebuie sa se mentina la dublul valorilor normale.

Coroborarea rezultatelor celor 3 teste: T.Q., T.H., APTT, conduce la etapa implicata in tulburarea hemostazei:

CID

Coagularea Intravasculara Diseminata, sau coagulopatia de consum este un sindrom caracterizat clinic printr-o intricare de manifestari trombotice si hemoragice.

Sub actiunea unor stimuli patologici, activarea coagularii este accelerata, cu consumarea factorilor de coagulare, a fibrinogenului si trombocitelor, cu formarea de monomeri de fibrina in circulatie (si microcirculatie) in mod haotic. Simultan si ca urmare a activarii cascadei de coagulare este declansat si sistemul fibrinolitic ( activarea plasminei ).

Sindromul CID poate apare in cursul unor afectiuni primare acute sau cronice:

Examenele de laborator evidentiaza modificari ale timpilor de coagulare, fibrinogenului, numarului de trombocite, in funtie de stadiile succesive de  evolutie a sindromului: ciagulare intravasculara si fibrinoliza secundara.