Electroforeza proteinelor pe folii de acetat de celuloza

Electroforeza proteinelor pe folii de acetat de celuloza

Materiale necesare

1. Aparatul de electroforeza alcatuit din:

redresor

camera umeda.

dispozitiv de fotometrare (densitometru) adaptat pentru folii de acetat de celuloza.

2. Suportul de migrare:

folii de acetat de celuloza

3. Reactivii:

a. Solutia tampon:

Tampon barbiturat pH = 8,6, tarie ionica 0,075

Se dizolva 0,331 g de veronal si 1,848 g de medinal in apa distilata si se aduce volumul la 120 ml.

b. Amestecul de colorant si fixator

Se dizolva 0,9 g de colorant Ponceau S, 13,4 g acid tricloracetic si 13,4 g acid sulfosalicilic in 1000 ml de apa distilata.

c. Solutia de acid acetic 5 %

d. Solutia pentru transparentizare:

Se amesteca 70 ml de acid acetic glacial cu 30 ml de acetat de etil. Se prepara zilnic inainte de utilizare.

Figura 50 Aparatul de electroforeza Figura 51 Sistemul de scanare

densitometrica si inregistrare a rezultatelor

Figura 52 Aspectul fractiunilor proteice

separate electroforetic pe folii de acetat de celuloza

Proba

Ser

Tehnica de lucru

Se umplu cuvele aparatului de electroforeza cu tampon barbituric.

Se scot foliile de acetat de celuloza din cutie, se noteaza si se imerseaza in solutia tampon timp de 15 minute, cu grija sa nu se prinda bule de aer in mediul de acetat de celuloza.

Se scot foliile din solutia tampon si se inlatura excesul de lichid cu ajutorul unei hartii de filtru.

Foliile se asaza in camera umeda intre cele doua cuve, avand grija ca cele doua capete ale membranei de acetat de celuloza sa fie imersate in solutia tampon.

Se aplica 0,25 µl din serul de analizat la capatul dinspre anod a foliei cu ajutorul unui dispozitiv special furnizat de firma.

Se da drumul la curentul electric pentru obtinerea separarii electroforetice (100 volti timp de 20 de minute).

Se intrerupe curentul, se scot membranele de acetat de celuloza si se imerseaza apoi in amestecul de colorant si fixator timp de 10 minute.

Se scot foliile din baia de colorant, se lasa sa se scurga excesul de solutie coloranta si se spala in trei bai succesive de acid acetic 5% (fiecare spalare dureaza doua minute). Se inlatura excesul de lichid si se lasa sa se usuce la temperatura camerei (sau la 60°C).

Se imerseaza incet foliile in alcool etilic timp de 5 minute, se trec in

solutia de transparentizare, unde raman doar un minut si apoi se lasa sa se usuce la 40 - 60°C.

Determinarea cantitativa a fractiunilor proteice se face prin scanare densitometrica cu ajutorul densitometrului care interpreteaza gelurile.

Observatii

Metoda este extrem de precisa si rapida, putand furniza rezultate in decurs de o ora. Detaliile referitoare la tehnica de lucru depind de aparatura accesibila.

Rezultate

a

b

Figura 53 a) Aspectul benzilor fractiunilor proteice separate

electroforetic pe folie de acetat de celuloza;

b) Rezultatul interpretarii foliilor prin scanare densitometrica

Traseul electroforetic prezinta un aspect tipic la adultul sanatos, sub forma unei diagrame cu diferite varfuri ce corespund fractiilor proteice (figura 53):

primul varf corespunde albuminei, care este fractiunea cea mai rapida, migrand cel mai repede;

al doilea varf corespunde α₁-globulinelor

al treilea varf este al globulinelor;

al patrulea varf este al β-globulinelor;

ultimul varf corespunde γ-globulinelor, cele mai lente fractiuni proteice.

Figura 54 Traseul electroforetic in conditii normale

Valori normale

Proteinemia normala presupune o valoare totala normala si o repartitie procentuala caracteristica a fiecarei fractiuni proteice:

Proteine totale 6,0 - 8,0 g%

Albumine    3,5 - 5,5 g% (50 - 62%)

Globuline    2,5 - 3,5 g% (38 - 50%)

α₁-globuline    0,2 - 0,4 g% (4 - 8%)

α₂-globuline    0,5 - 0,9 g% (6 - 10%)

β-globuline  0,6 - 1,1 g% (8 - 15%)

γ-globuline  0,7 - 1,7 g% (10 - 20%)

Fibrinogen  0,2 - 0,4 g%

Raport Albumine/Globuline: 1,2 - 1,5. Valoarea acestui raport conditioneaza VSH-ul.   

Variatii fiziologice

Electroforeza proteinelor serice ale sugarului este asemanatoare cu cea a adultului, dar prezinta o scadere a varfului γ-globulinelor, mai ales in perioada de 3 - 6 luni, cand exista o hipo-gamaglobulinemie fiziologica. Nou-nascutul si prematurul nu prezinta aceasta anomalie insa albuminemia este frecvent scazuta in perioada neonatala.

La adulti electroforegrama este cea descrisa mai sus, fara diferente majore intre cele doua sexe. Nu se observa nici o variatie semnificativa a valorilor la femei, pe durata ciclului menstrual.

La varstnici se observa in general o scadere a varfului γ-globulinelor asemanatoare cu scaderile din deficitele imune si o hipoalbuminemie. 75 % dintre batrani prezinta o hipoproteinemie datorata scaderii simultane a albuminelor si imunoglobulinelor.

Variatiile determinate de oboseala (diminuarea gamaglobulinelor) si de conditiile climatice sunt relativ reduse. O dieta deficitara in proteine, poate influenta traseul electroforetic, in sensul diminuarii albuminelor si cresterii globulinelor, in special a fractiunii beta.

Sarcina, mai ales in al treilea trimestru, determina o diminuare a albuminelor si o crestere a α₂ si β-globulinelor, in timp ce γ-globulinele au valori normale.

Variatii patologice

Cresterea raportului albumine/globuline nu are importanta prea mare, dar scaderea acestuia sub cifra 1 sugereaza boli care scad sinteza de albumina sanguina sau boli care cresc sinteza de globuline. Cauzele care duc la scaderea albuminelor sunt aceleasi care produc si scaderea proteinelor totale.

Albumine

Valori scazute (hipoalbuminemii):

scaderea aportului:

malnutritie;

malabsorbtie;

scaderea sintezei:

hepatita cronica;

ciroza;

pierderi:

sindrom nefrotic;

enteropatii exsudative;

cresterea distrugerilor:

hemoragii;

arsuri;

infectii grave;

hipertiroidie;

diabet zaharat;

supuratii;

analbuminemie congenitala.

Valori crescute (hiperalbuminemii) sunt foarte rare:

leucemie limfatica cronica;

hipogamaglobulinemii.

Globuline

Scaderea globulinelor are valoare prognostica importanta in hepatite.

Valori scazute (hipoglobulinemii):

hepatite cronice grave;

ciroze avansate;

pierderi proteice indelungate:

digestive: enteropatii diareice, neoplasm digestiv;

renale: sindrom nefrotic;

arsuri extinse;

eczeme plasmoragice;

hipo/agamaglobulinemii genetice.

Valori crescute (hiperglobulinemii):

infectii si inflamatii cronice;

nefropatii cronice;

± tumori maligne;

perioada de convalescenta boli acute;

stari postagresive acute (reactie la scaderea albuminelor);

colagenoze;

hepatite acute si cronice.

α₁-globuline

Au valoare prognostica nula si valoare diagnostica scazuta.

Valori scazute:

etilism cronic;

anemii;

ciroze (asociaza scadere de α₂-globuline);

ictere mecanice cu angiocolita.

Valori crescute:

boli infectioase acute: reumatism articular acut, pneumonii;

poliartrita reumatoida;

astm bronsic;

infarct miocardic;

neoplasme;

hipertiroidie;

diabet zaharat;

necroze intinse;

arsuri;

sindroame nefrotice (asociaza crestere α₂-globuline si scadere albumine si γ-globuline);

afectiuni hepatice:

ciroza biliara;

amiloidoza hepatica;

hepatite epidemice (cresteri usoare).  

α₂-globuline

Au valoare diagnostica foarte redusa si valoare prognostica pentru hepatitele grave.

Valori scazute:

izolate sau asociate cu scaderea α₁-globulinelor in ciroze hepatice severe sau oricare afectiune hepatica grava!

Valori crescute:

sindrom nefrotic;

cancere hepatice severe;

atrofie hepatica;

hepatite epidemice si ictere mecanice de cauza neoplazica (cresteri usoare).

β-globuline

Au valoare diagnostica si pronostica pentru gravitatea hepatitelor.

Valori scazute:

afectiuni hepatice grave;

atrofie hepatica acuta;

ictere grave.

Valori crescute:

primele saptamani postinfarct miocardic acut;

diabet zaharat;

amiloidoza;

sindrom nefrotic;

unele neoplasme (in special cele metastatice);

sarcoidoza;

ciroze (cresc incet dar ajung la valori ridicate);

hepatite:

acute epidemice;

toxice;

etilice;

icter mecanic.

γ-globuline:

Valori scazute:

sindrom nefrotic;

agamaglobulinemii;

hipogamaglobulinemii;

congenitale;

dobandite:

mielom cu lanturi usoare;

leucemie limfatica cronica;

limfoame.

Valori crescute - semnifica un proces imunologic cronic asociat cu:

infectii subacute si cronice;

parazitoze, viroze;

inflamatii cronice;

boli de colagen:

poliartrita reumatoida;

lupus eritematos sistemic;

afectiuni hepatice:

hepatite cronice active;

ciroza hepatica;

neoplazii:

boala Hodgkin;

leucemie mielomonocitara cronica